基于熱溶解膜過濾法的太歲古菌菌群結構研究

王朝江,王世清,李 慧,信艷杰,高春燕

（河北省農林科學院遺傳生理研究所,中國河北 石家莊 050051）

太歲是一種在中國古籍有記載[1],現代不斷發現[2],科學歸屬正在探索的神秘物體[3～4]。1992年發現的現代首例太歲被鑒定為“以黏菌為主體的特大型黏菌復合體”[5],但該結論又于2010年被作者自我否定[6]。于是,研究者不得不轉向探索太歲中存在的其他菌類作為主體菌的可能性。

采用培養方法,研究者在太歲中分離出了絲狀真菌、酵母、細菌[7～9];采用非培養方法,特別是高通量測序技術,研究人員獲知了太歲細菌和古菌的菌群結構,不僅證明太歲中細菌種群多樣性豐富[10],還發現有11個屬的古菌存在[11],但在不同太歲間檢測到的細菌和古菌的優勢屬差別巨大。細菌中檢出的優勢屬有Edaphobacter、梭菌屬（Clostridium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）[10]、鹽單胞菌屬（Halomonas）[12],其間沒有相同的屬,即使在兩個形態近似、產地相同的太歲間也是如此。古菌有相同的優勢屬,分別是甲烷桿菌屬（Methanobacterium）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）和甲烷球菌屬（Methanosphaera）,但它們在不同太歲間的相對豐度差別很大。這種差異化的結果不能在不同形態太歲間建立起以共有菌群為紐帶的聯系,也不能為分離太歲的主體菌準確提供目標信息。

高通量菌群測定結果的差別,無疑由所用DNA間的差別決定,而DNA又受其提取方法的影響,對此,已不乏研究報道[13]。本文作者用熱溶解膜過濾方法提取的DNA,重測同一太歲的細菌菌群結構,結果證明:之前采用的常規材料處理方法,未考慮太歲質地如膠、不溶于冷水并含有大量多糖類物質（包括聚乙烯醇）的特性,所提取的DNA包含的細菌信息片面,導致測知的菌群結構嚴重失真,真正優勢菌群的相對豐度降低或漏檢,非優勢菌群則以優勢菌群面目出現;同時,本文作者還通過設置不同取樣位置和重復的方法,從極富多樣性的細菌群落中確定出了優勢菌群[14]。目前,尚未有該方法在太歲古菌菌群結構研究中應用的報道。

古菌通常存在于高溫、高鹽、缺氧、強酸、強堿等極端環境,分離培養的條件苛刻,且生長慢不易觀察[15]。因此,古菌優勢菌的分離較細菌更加依賴于高通量測序技術,只有通過多次測定,特別是建立在適合太歲材料特性的DNA提取方法基礎上的測定,才能獲知太歲準確的古菌優勢菌群信息,同時也可進一步證實熱溶解膜過濾方法對已有結果偏差的修正效果。

1 材料與方法

1.1 供試材料

太歲樣本發現于河南省三門峽市黃河流域,呈紅褐色和尖圓柱體狀,質感如低彈性橡膠,2007年由筆者購回收藏。

1.2 試劑和儀器

十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB）（分析純,天津市大茂化學試劑廠）;2×Taq Master Mix（北京全式金生物技術有限公司）;DNA檢測試劑盒（Qubit 2.0,美國Life公司）。PCR儀（T100,美國Bio-Rad公司）;MiSeq高通量測序平臺（2×300,美國Illumina公司）。

1.3 方法

1.3.1 取樣與DNA提取

在太歲的表里層不同部位做兩次重復取樣。表層取樣部位位于表皮,深約0.8 cm,取樣前用無菌水和濾紙對外表做清潔處理,樣品編號為SAO2和SAO3;里層取樣部位位于表皮下2～3 cm處,樣品分別編號為SAI2和SAI3。每份樣品濕重0.20 g,切碎后加水水浴溶化,用針頭濾器過濾溶化液,即熱溶解膜過濾法[16],之后切取濾膜用作DNA提取。DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后,送生工生物工程（上海）有限公司進行測序。

1.3.2 高通量測序

采用DNA檢測試劑盒測定DNA含量后,使用融合有MiSeq平臺接頭序列和標簽（barcode）序列的古菌特異性引物349F和806R,擴增16S rDNA的V3～V4區。擴增體系和程序見文獻[11]。回收4個樣品DNA的擴增產物,用DNA檢測試劑盒精確定量,各取10 ng混合后測序。

1.3.3 測序數據處理與深度驗證

用Cutadapt軟件去除測序原始數據的接頭,用Pear軟件[17]完成序列拼接,然后按照barcode識別得到各樣本的原始序列（raw reads）。原始序列經Prinseq軟件[18]質控,去除嵌合體、非擴增區域序列、低于閾值的BLASTn比對序列[19],得到優質序列（seq reads）。使用Usearch（version 5.2.236）軟件[20]在97%的相似度水平下將優質序列聚類為不同的操作分類單元（operational taxonomic unit,OTU）。

利用覆蓋率（Coverage）和香農（Shannon）指數稀疏曲線評價測序數據量的合理性。覆蓋率計算公式:C=1-n1/N,式中:n1為只含有1條序列的OTU數目,N為序列總數。

1.3.4 古菌多樣性及OTU分布分析

采用α多樣性評價古菌的多樣性及豐度。其中,香農指數、辛普森（Simpson）指數反映群落物種多樣性,前者數值越高,或后者數值越低,則多樣性越高;ACE指數、Chao1指數反映物種豐度,值越大,則豐富度越高。

使用R的韋恩（Venn）圖軟件統計樣品中共有的和獨有的OTU數目,分析其在樣品間的重疊情況[14,16]。

1.3.5 古菌物種分類及優勢菌群構成分析

選擇OTU中豐度最高的序列作為代表性序列,用 Na?ve Bayesian assignment算法,對其進行門、綱、目、科、屬等不同水平的分類[21]。相對豐度是各個類群的序列數占總序列數的百分比[22]。相對豐度高且樣品間共有的類群被初步確定為優勢菌群。為準確反映物種間的相對豐度差別,該類數值保留4位小數。

1.3.6 OTU對優勢屬的支撐分析

分析優勢屬中OTU的數目構成及其相對豐度,并根據不同樣品間是否存在共有且占比高的OTU,判定優勢屬是否是太歲中古菌的真正優勢菌群[14,16]。

2 結果與分析

2.1 樣品DNA的提取和擴增

SAO2、SAO3、SAI2、SAI3 等4 個樣品中提取的DNA 的質量濃度分別是 7.20 ng/μL、10.36 ng/μL、0.27 ng/μL、2.20 ng/μL,均高于高通量測序需要的最低質量濃度（0.05 ng/μL）。樣品DNA及其擴增產物的電泳結果見圖1。

圖1 4個樣品中提取的DNA及其擴增產物電泳圖M1:λDNA/HindⅢ單切DNA分子量標準;M2:DNA分子量標準 DL2000;1～4:SAO2、SAO3、SAI2、SAI3樣品中提取的DNA;5～8:SAO2、SAO3、SAI2、SAI3 的 DNA 擴增產物。Fig.1 Electrophoresis of sample DNAs and amplification productsM1:λDNA/Hind Ⅲ DNA marker;M2:DL2000 DNA marker;1～4:Extracted DNAs from four samples;5～8:DNA amplification products of four samples.

2.2 測序數據及深度驗證

高通量測序后獲得的4個樣品的原始序列、質控序列（clean reads）和優質序列的數目,以及優質序列聚類為OTU的數目與文庫覆蓋率見表1。從表1可以看出,里層樣品所含OTU數目明顯低于表層樣品。如此,若假定太歲為表層生長,可推知其由表至里存在種群消失現象;若為里層生長,則外部的多數菌對太歲生長非必需,為環境黏附冗余。覆蓋率指數均接近1,表明樣本中所有的序列基本被測出,測序結果能夠代表樣本的真實情況。

表1 4個樣品的序列及OTU數目信息Table 1 Sequence and OTU numbers of 4 samples

另外,4個樣品的香農稀疏曲線趨于平穩,這也說明測序數據量合理,更多的數據量只會產生少量的新物種（圖2）。

圖2 4個樣品的香農指數稀疏曲線Fig.2 The Shannon rarefaction plot of 4 samples

2.3 古菌α多樣性及OTU分布

4個樣品的α多樣性指數見表2。從表中可以看出,多樣性指數在樣品間的變化幅度很大,說明各樣品在物種多樣性和豐度上存在巨大差異,多個重復樣品對獲得正確菌群結構是必需的。此外,SAO2和SAO3的香農指數、ACE指數、Chao1指數均高于SAI2和SAI3,SAI3的香農指數最低,說明表層樣品的物種多樣性遠高于里層樣品,同時也說明太歲里層的古菌種類單一,且分布極不均衡。

表2 4個樣品的α多樣性指數Table 2 Alpha diversity indexes of 4 samples

OTU在樣本間的重疊和獨有情況見圖3。從圖中可以直觀看出,4個樣品共有OTU只占每個樣品OTU的很少一部分,說明其共有種類少且分布極不均衡。通過核對相對豐度數據,我們發現共有的 3 個 OTU（OTU2、OTU63、OTU107）存在超高占比,其占比之和在SAO2、SAO3、SAI2和SAI3樣品中依次為89.950 3%、94.561 7%、71.842 6%、99.588 5%,特別是OTU2,在SAI3中獨占96.811 0%,提示供試太歲中雖然菌群種類多但優勢種類突出。

圖3 4個樣品的OTU分布韋恩圖Fig.3 The OTU Venn diagram of 4 samples

2.4 太歲古菌的物種分類及優勢類群解析

4個樣品在各分類水平上所含分類單元總數和百分占比≥0.01%的數目情況見表3。從表3中可以看出,樣品在各分類水平上的古菌總數,在表里層位置間是表層多于內部,重復間亦有差異;百分占比≥0.01%的古菌數目在各樣品間的差別,遠小于總數間的差別,說明供試太歲中有大量極低相對豐度的古菌菌群存在。

表3 4個樣品在門、綱、目、屬分類水平上的古菌數目分析Table 3 The archaea number in 4 samples at different taxonomy levels

門分類水平上,共檢出16個門。低于0.01%占比的門數在樣品間相差1～7個,差別最大的是SAO2樣品。SAO2和SAO3共檢出16個門,SAO2中全含,SAO3中僅有8個,存在差異的8個門在SAO2中的占比為0.073 5%,二者共有的8個門在SAO2和SAO3中的占比分別為99.926 5%和100.000 0%。SAI2和SAI3共檢出9個門,表面相差2個,但由于SAI2獨有4個,SAI3獨有2個,所以兩個樣品實際相差6個門;二者共有的3個門在SAI2和SAI3中的占比分別為99.951 9%和99.993 7%。

相對豐度大于1%的門共檢出4個,分別是廣古菌門（Euryarchaeota）、奇古菌門（Thaumarchaeota）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和烏斯古菌門（Woesearchaeota）。SAO2、SAO3、SAI2 和 SAI3 所涉及的數目分別為4、3、2、2。廣古菌門和奇古菌門為共有門,它們在 SAO2、SAO3、SAI2和 SAI3中的占比之和依次為95.216 9%、97.684 0%、99.935 3%、99.971 5%。廣古菌門在表層中的占比基本與奇古菌門持平,但在里層SAI2和SAI3中的占比分別為72.229 1%、97.181 3%,優勢突出。以上信息說明,樣品間共有門的占比具絕對優勢,且里層更加突出。

綱水平上共檢出27個綱,低于0.01%占比的綱在SAO2中最多,占總數的一半。SAO2和SAO3共檢出27個綱,相差17個,均為SAO2獨有,占比之和為0.205 8%;二者共有的10個綱在各自的占比分別為99.794 2%和100.000 0%。SAI2和SAI3共檢出10個綱,表面相差4個綱,但由于SAI2獨有6個,SAI3獨有2個,所以兩個樣品實際相差8個綱;二者共有的4個綱在各自的占比分別為99.927 1%和99.993 7%。

相對豐度大于1%的綱共檢出5個,分別是甲烷桿菌綱（Methanobacteria）、甲烷微菌綱（Methanomicrobia）、奇古菌門未分類綱、未分類綱（unclassified）和烏斯古菌門未分類綱。SAO2、SAO3、SAI2和SAI3所涉及的數目分別為5、3、3、2,其中,甲烷桿菌綱和奇古菌門未分類綱為共有綱,二者占比之和依次為93.585 0%、97.315 4%、98.500 3%、99.949 4%。另外,甲烷桿菌綱在SAI3中的占比高達97.159 1%,同樣是內部占比高于外部。

目分類水平上,共檢出39個目。低于0.01%占比的目在SAO2樣品中最多,為24個。SAO2和SAO3共檢出39個目,表面相差25個目,但由于SAO2獨有26個,SAO3獨有1個,所以兩個樣品實際相差27個目;二者共有的12個目在各自的占比分別為99.790 9%和99.995 2%。SAI2和SAI3共檢出15個目,表面相差7個目,但由于SAI2獨有8個,SAI3獨有1個,所以兩個樣品實際相差9個目;二者共有的6個目在各自的占比分別為99.877 2%和99.996 8%。

相對豐度大于1%的目有6個,分別是甲烷桿菌目（Methanobacteriales）、甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）、Nitrosopumilales、Nitrososphaerales、未分類目（unclassified）和烏斯古菌綱未分類目。SAO2、SAO3、SAI2 和 SAI3 所包含的數目分別為 5、3、3、2,其中,甲烷桿菌目和Nitrososphaerales為共有目,二者占比之和依次為91.835 5%、96.346 6%、98.490 4%、99.949 4%。SAO2樣品中共有目占比較低的原因是其單獨含有占比之和為5.668 5%的烏斯古菌綱未分類目等3個目。

屬分類水平上,共檢出64個屬。低于0.01%占比的屬在SAO3和SAI2樣品中占近半,在SAO2中占2/3。SAO2和SAO3共檢出62個屬,表面相差43個屬,但由于SAO2獨有44個,SAO3獨有1個,所以兩個樣品實際相差45個屬;二者共有的17個屬在各自的占比分別為99.683 1%和99.998 4%。SAI2和SAI3共檢出19個屬,表面相差13個屬,但因SAI2獨有14個,SAI3獨有1個,所以兩個樣品實際相差15個屬;二者共有的4個屬在各自的占比分別為99.865 6%和99.998 4%。以上數據說明表層和里層中非共有屬的占比極低。

相對豐度大于1%的屬共檢出5個,分別是甲烷桿菌屬、甲烷絲菌屬（Methanothrix）、Nitrosopumilus、亞硝化球菌屬（Nitrososphaera）和未分類屬（unclassified）,SAO2、SAO3、SAI2 和 SAI3 所涉及的數目分別為4、3、3、2。5個屬占比之和最低的仍有98.279 9%,其中,甲烷桿菌屬和亞硝化球菌屬為共有屬,二者在SAO2、SAO3、SAI2和SAI3中的占比之和依次為91.654 1%、96.312 8%、98.480 4%、99.944 6%,占絕對優勢。此外,甲烷桿菌屬和亞硝化球菌屬的占比在表里層不均衡。前者在SAO2、SAO3、SAI2、SAI3 樣品中的占比分別為44.504 7%、55.526 1%、70.784 2%、97.154 4%,里層明顯高于表層;后者則是表層高于里層（圖4）。

圖4 4個樣品中相對豐度大于1%的屬結構分布圖Fig.4 The column chart of 5 dominant genera with relative abundance higher than 1%

2.5 OTU對優勢屬的支撐能力

4個樣品中甲烷桿菌屬和亞硝化球菌屬所包含的OTU數目、相對豐度位于前兩位的OTU及其占比情況見表4。從表中可以看出,兩個屬均含有眾多OTU,其數目均是表層多于里層;在每個屬中第一、二位OTU的相對豐度差別極大,第一位OTU的占比近乎等于其所在屬的占比;OTU2在4個樣品的甲烷桿菌屬中的占比均位列第一,同時也是4個樣品的共有OTU;在亞硝化球菌屬中,占比高的OTU63分布在表層,內部極少且不共有。上述結果說明,僅甲烷桿菌屬是有高豐度OTU支撐的真正優勢屬,其中優勢種明顯,可代表太歲所含古菌的優勢菌群。

表4 甲烷桿菌屬和亞硝化球菌屬的OTU分析Table 4 OTU analysis of Methanobacterium and Nitrososphaera in 4 samples

3 結論

供試太歲所含古菌分屬16個門、27個綱、39個目、64個屬。優勢菌群是甲烷桿菌屬,相對豐度在43.859 5%～96.811 0%。

太歲所含古菌的多樣性是表層高于里層,而優勢菌群的相對豐度是里層顯著高于表層。

各樣品的菌群在種類和數量上均存在差別,有大量非共有菌群,其可判定為機會性進入太歲組織中的雜菌。

4 討論

采用熱溶解膜過濾法提取DNA所測得的種群結構,較之前的測定結果[11]變化巨大。大于1%的屬,本次內部樣品測得4個,而之前的內部樣品測得10個,其中僅甲烷桿菌屬相同,但本次所測的豐度大幅升高。甲烷桿菌屬占比在SAI2和SAI3樣品中分別為70.784 2%、97.154 4%,比之前結果分別上升39.554 2%和65.924 4%。對于之前測定的占比最高和第三的兩個屬——甲烷球菌屬（34.15%）與甲烷短桿菌屬（17.25%）,前者在本次僅測得1條序列（read）,占比0.001 6%,后者卻未檢測到。此外,和之前結果相比,本次測定的豐度次高的亞硝化球菌屬的占比也大幅上升,其在SAI2和SAI3樣品中的占比分別為27.696 2%和2.790 2%,而之前的結果則為0.28%[11]。以上數據說明,采用熱溶解膜過濾法提取的DNA,含有太歲中古菌主體菌群的更多信息。主體菌群信息的增加,相對擠占和壓減了非優勢菌群的占比,凸顯了正確的菌群結構。另外,本次研究中設置重復樣品和著重分析其間共有菌群的方法,非常有助于排除機會性菌的干擾,從而解析出真正的優勢菌群。

甲烷桿菌屬作為兩次測定的古菌優勢菌群,結果可信度高,其在形態和代謝特性上均具有助于太歲形成的可能性。形態上,甲烷桿菌屬菌體彎曲、鉤形到長桿狀,可以形成長的絲狀體到類球狀體,具備結團能力[23～25];代謝上,其能產生很多胞外聚合物,電鏡下可觀察到該聚合物從一個細胞的外表面延伸黏附至另一細胞,具備使菌體團塊不易散開的物質基礎[26],可以形成絮狀沉淀[24,27]。另外,剖開剛采自池塘污泥的其他柱狀太歲,能觀察到類似氣腔和呈膜片狀的結構（圖5）,說明太歲中有厭氧產氣的菌類存在。

圖5 一柱狀太歲切面出現的氣腔和膜片結構Fig.5 Air cavities and membranes in the section of a columnar Taisui

甲烷桿菌屬和亞硝化球菌屬在太歲中并存,且豐度占比在表里層樣品中呈相反的趨勢,這至少反映二者對氧氣的生理需求有差異。資料顯示,甲烷桿菌屬是嚴格厭氧的,亞硝化球菌屬在低氧環境下則具有一定耐受能力[28～29],這可使表層組織中亞硝化球菌屬占比較高獲得合理解釋,同時也提示從太歲的表層到內部,氧氣濃度呈現出從低氧到無氧的變化。另外,亞硝化球菌還是無泡曝氣生物反應器生物膜的組成成分之一[29],而生物膜是一種菌膠團,一定程度上具有太歲狀物質的特征。