運動結合藥物對糖尿病小鼠骨骼肌炎癥的影響

俞瑩瑩，趙彥，譚朝文，鄭玉嬋

南京體育學院運動健康學院，江蘇 南京 210000

糖尿病是慢性內分泌代謝紊亂疾病，常易引發“慢性低度炎癥反應狀態”。骨骼肌是機體慢性炎癥發生發展的重要部分，藥物和運動干預能夠有效改善骨骼肌炎癥反應[1-2]。單純運動干預對部分長期患糖尿病的患者的療效不穩定[3]，而單純二甲雙胍藥物干預易引發高乳酸血癥和高酮癥等不良反應[4-5]，兩者結合可起到有益的疊加效果，二甲雙胍結合運動干預是必行的有效治療方案[6]。二甲雙胍聯合運動干預相對單純二甲雙胍或單純有氧干預可更有效的降低血清白細胞介素-1β（IL-1β），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和單核細胞趨化因子（MCP-1）炎癥因子水平,改善血管炎癥反應[7]。二甲雙胍抗阻聯合干預在降低體脂含量、提高基礎代謝方面的效果優于單純二甲雙胍組和抗阻組[8]。有氧運動、抗阻運動能通過改善血脂代謝，調控腫瘤壞死因子TNF-α、白介素6的表達干預糖尿病患者的血糖，緩解慢性炎癥反應，但這兩種運動方式中哪一種對已有二甲雙胍干預的糖尿病動物模型，降低血糖的效果更明顯還有待研究。

該研究通過對二甲雙胍干預的db/db小鼠施以不同運動訓練，探討不同運動訓練結合二甲雙胍對糖尿病小鼠血糖、血脂代謝變化、骨骼肌炎性反應的影響，推測可能存在的降糖機制，為進一步選擇最佳聯合干預方案治療糖尿病提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

6～8周齡清潔級雄性C57BL/ks db/db小鼠24只。分籠飼養，室溫控制在20～24℃，相對濕度控制在50%～70%，自由攝食和飲水，12/12 h光照，通風流暢。適應性喂養1周后隨機分為二甲雙胍對照組（C，n=8）、抗阻運動干預組（P，n=8）和有氧運動干預組（O，n=8）。所有小鼠飼喂高脂飼料（基礎飼料54.6%，豬油16.9%，蔗糖14%，酪蛋白10.2%，預飼料2.1%，麥芽糊精2.2%）。

1.2 方法

C組每日灌胃二甲雙胍，劑量為200 mg/（kg·d），給藥體積為0.05 mL/10 g體質量[9]。每日監控小鼠飲水量，每周調整1次藥物劑量。O組采用中等強度有氧跑臺，并視小鼠適應狀況做適當調整。跑臺坡度為0，15 m/min,60 min/（次·d），4次/周[10]。正式訓練前，先進行1周適應性跑臺訓練，坡度為0，速度由7 m/min逐漸增至15 m/min。以小鼠尾部負重爬梯方式建立力量運動模型，采用自制爬梯，進行中等強度尾部負重爬梯訓練[11]，梯高1 m，梯間隔1 cm，傾斜度85°，隔天訓練，3組/次，每組4個循環，每次間隔1 min，組間隔2 min。第1周為不負重適應性訓練，第2周起始負重負荷為自身體質量的30%，隨后逐漸遞增至適合的負重重量、爬梯重復次數及每組時間間隔。運動訓練組藥物劑量與給藥方法同藥物對照組。

1.3 取材

最后一次訓練結束后24 h處死實驗動物，處死前12 h禁食。小鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.5 mL/100 g），斷頭取血。取右側股四頭肌外側頭，置于液氮中速凍，后轉入-80℃超低溫冰箱中保存待測。

1.4 觀察指標

1.4.1 血糖 每周用羅氏便攜血糖儀與羅氏血糖試紙測定大鼠FBG空腹血糖值。

1.4.2 血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量測定 采用相應試劑盒檢測，以上指標檢測均按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.3 右側股四頭肌TNF-α、IL-6相對含量測定 取股四頭肌約50 mg冰上剪碎置于研磨管中，加入0.35 mL裂解液，OMINI Besd Ruptor 24型磁珠勻漿儀勻漿，12 000 g離心20 min，轉上清液于離心管中，BCA法測定蛋白濃度后變性。蛋白變性并調平濃度后即可進行SDS-PAGE凝膠電泳實驗。采用10%的分離膠電泳，濕轉法將蛋白轉至PDVF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，棄掉封閉液加入一抗（anti-TNF-α，1：1 000，Cell Signaling，美國；anti-IL-6,1：1 000，Proteintech，美國;anti-beta Tubulin,1:2 000,Proteintech，美國）4℃孵育過夜，1×TBST洗膜3次，10 min/次，根據一抗加入相應稀釋的二抗（anti-rabbit IgG-HRP，1:5 000），室溫避光孵育1.5 h，再次洗膜，滴加ECL，置于Bio-Rad Chemidoc XRS+曝光（Bio-Rad，美國），用圖像分析軟件Image LabTM Software進行灰度分析。

1.5 統計方法

采用SPSS 20.0統計學軟件分析數據，計量資料的表達方式為（），采用單因素方差分析（one way-ANOVA）及t檢驗，采用Pearson相關分析進行兩變量間的相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。蛋白印跡法用Image-Lab進行分析，統計圖表用GraphPad Prism 8制作。

2 結果

2.1 3組小鼠血糖水平對比

訓練后，P組和O組血糖均差異有統計學意義（P＜0.01）。8周訓練后，與C組相比，P組、O組血糖顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），且O組顯著低于P組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 3組小鼠訓練前后空腹血糖對比

注：*P＜0.05，**P＜0.01，與C組比較；#P＜0.05，與P組比較；與干預前比較△P＜0.05，△△P＜0.01

時間 C組 P組 O組訓練前訓練后17.54±3.92 20.41±2.88 18.74±4.75（14.91±1.41）**△20.83±2.42（13.04±1.40）**△△#

圖1 各組小鼠干預前后空腹血糖含量

2.2 3組小鼠血液中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量對比

與C組相比，P組小鼠TC含量顯著降低，HDL-C含量顯著提高，差異有統計學意義（P＜0.05），O組TG含量顯著降低，HDL-C含量極顯著提高，差異有統計學意義（P＜0.01）。O組較P組HDL-C含量顯著提高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 3組TC、TG、HDL-C、LDL-C含量

表2 各組小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C含量對比[（），mmol/L]

表2 各組小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C含量對比[（），mmol/L]

注：與C組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與P組比較P#＜0.05

指標 C組 P組 O組TC TG HDL-C LDL-C 7.03±0.79 0.99±0.22 2.51±0.53 0.91±0.15（6.27±0.51）*0.94±0.30（3.01±0.49）*0.81±0.21 6.67±0.82（0.62±0.12）**#（3.57±0.21）**#0.86±0.07

2.3 3組小鼠骨骼肌中TNF-α、IL-6含量對比

TNF-α和IL-6在3組db/db小鼠右側股四頭肌中均有表達。Western Blot結果顯示，8周干預后，P組和O組均能提高IL-6的表達，且O組更為顯著，差異有統計學意義（P＜0.05）。P組、O組TNF-α的表達均有不同程度的下降，但與C組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3、圖3。

圖3 3組小鼠IL-6、TNF-α的表達

表3 3組小鼠骨骼肌中TNF-α、IL-6含量對比

表3 3組小鼠骨骼肌中TNF-α、IL-6含量對比

注：與C組比較P*＜0.05，P**＜0.01

項目 C組 P組 O組IL-6蛋白表達TNF-α蛋白表達0.61±0.12 0.88±0.24（0.89±0.14）*0.79±0.08（1.00±0.07）**0.77±0.13

3 討論

研究發現，8周有氧或抗阻運動均可以明顯降低二甲雙胍干預的db/db小鼠血糖水平，一定程度上改善血脂代謝；同時，有氧運動組能顯著抑制炎癥反應。長期運動聯合藥物干預的糖尿病動物模型具有顯著控制血糖和調節血脂代謝作用，其中有氧運動聯合組效果更為顯著，且能更有效的抑制骨骼肌炎癥反應。

3.1 不同運動對二甲雙胍干預的db/db小鼠血糖的影響

高血糖現象是2型糖尿病的基本特征，通過合理用藥及適當的鍛煉，能夠控制糖尿病患者的血糖[12]。8周干預后，聯合運動組小鼠血糖與單純藥物對照組相比均顯著降低，且有氧組降低血糖的效果更加明顯。近年來研究發現更多對胰島素敏感性有益的適應性變化，長期的有氧運動可以增加毛細血管密度，可以提高葡萄糖向肌肉輸送的效率，從而實現更大的運輸，而阻力訓練卻沒有達到相應的效果[13]。氧化型肌纖維比酵解型肌纖維，在肌糖原消耗量較少的情況下可引起葡萄糖轉運速率較高增加。而有氧運動與抗阻訓練相比可更多地動員氧化型肌纖維[14]，因而在藥物基礎上聯合有氧運動干預對糖尿病小鼠空腹血糖影響更為顯著。可見，8周不同運動均可以降低二甲雙胍干預的db/db小鼠血糖水平，且有氧運動效果更佳。

3.2 不同運動對二甲雙胍干預的db/db小鼠血脂代謝的影響

2型糖尿病患者通常伴有血脂紊亂，血脂指標是衡量2型糖尿病患者重要指標之一。該研究發現有氧或抗阻運動對二甲雙胍干預的糖尿病小鼠血脂代謝都有一定的改善作用，其中抗阻運動組降低TC的作用更加明顯，而有氧運動組可以更有效地降低TG、提高HDL-C，對HDL-C的影響最為顯著。糖尿病患者普遍存在胰島素抵抗，胰島素抵抗時，進行脂代謝調節的血漿脂蛋白酯酶活性下降，進而使脂解加強，游離脂肪酸FFA釋放增多。最終由于過多的FFA以TG的形式在非脂肪組織中過度沉積，進而造成對該組織的損傷[15]。運動能有效增加肌肉和脂肪組織內脂蛋白酶的活性,從而促進肌肉攝取和利用更多的脂肪酸和TC，加快TC和磷脂轉移到HDL上，血液中TC和TG水平降低，在很大程度上有效地緩解和預防TC在動脈管壁的沉積[16]。而耐力運動能更明顯地使血漿HDL-C水平升高[17]，與該研究結果一致，有氧運動組的HDL-C明顯高于另外兩組，提示有氧運動組降血脂的作用更加明顯。

3.3 不同運動對二甲雙胍干預的db/db小鼠炎性反應的影響

研究表明，骨骼肌是機體慢性炎癥發生發展的重要部分[18]。有氧運動與二甲雙胍運動聯合干預可以不同程度地降低血清炎癥因子水平，說明有氧運動與二甲雙胍聯合干預可以改善血管炎癥反應[19]。2型糖尿病患者進行康復訓練的研究中發現抗阻訓練可明顯地降低患者體內的炎癥水平[20]。但不同運動對二甲雙胍干預的db/db小鼠骨骼肌炎性因子的影響尚未見報道。該研究選用了促炎因子TNF-α和抗炎因子IL-6[22]來反映骨骼肌炎癥狀態。結果顯示抗阻和有氧運動雖然都能降低TNF-α表達水平，但影響幅度較小。長期中等運動量的運動可降低機體慢性炎癥，而中小運動量的運動對TNF-α的變化影響不大[21]。表示TNF-α變化不大可能與運動量較小有關。兩種干預均能夠不同程度地升高IL-6的表達，且有氧組效果更為顯著。造成此現象的原因可能是抗阻訓練過程中易引起骨骼肌超微結構的損傷，對體內炎性因子水平產生影響[20]。此外，體內炎性因子與氧化應激存在密切關系，6周的有氧運動能有效提高T2MD大鼠的抗氧化應激能力，從而達到抗炎的效果[23]。因而，提示在二甲雙胍干預的基礎上聯合有氧運動干預對糖尿病引起的骨骼肌炎癥有較好的治療效果。

綜上所述，有氧運動能有效改善二甲雙胍干預的糖尿病小鼠血脂代謝，提高抗炎因子IL-6的表達，緩解骨骼肌炎癥，降低2型糖尿病小鼠空腹血糖，且降糖效果明顯優于抗阻運動，為糖尿病康復選擇最佳的聯合干預方案。