17種常用除草劑對蚯蚓的急性毒性

李濤，孟丹丹，郭水良，袁國徽，錢振官，呂衛光*

1. 上海市農業科學院，上海 201403；2. 上海師范大學生命與環境科學學院，上海 200234

被稱為“生態系統工程師”的蚯蚓，是土壤系統的重要組成部分（Ojha et al.，2014），在改良土壤、消解農業廢棄物、提高土壤養分和作物產量方面發揮著重要的作用（吳娜娜等，2015；Manono，2016）。蚯蚓是土壤大型無脊椎動物的代表，其生物量約占土壤動物生物量的 60%—80%（Jouquet et al.，2010）。蚯蚓數量被認為是土壤健康和衡量農業可持續發展的有效指標（Blouin et al.，2013；郭佳惠等，2016）。以農用化學品高投入為特點的現代集約農業在過去幾十年中取得了巨大的成功，但是農藥化肥的大量使用也對生態環境造成了污染（Hackenberger et al.，2018）。農藥是土壤污染物的重要來源（付青等，2019；譚華東等，2021），土壤中的蚯蚓可通過皮膚直接接觸或取食土壤中受污染的食物而接觸農藥，從而引起蚯蚓死亡或影響其生長（Wang et al.，2000）。蚯蚓對土壤中的污染物較為敏感，是開展土壤生態風險評估的重要指示生物（宋雪英等，2016；張慧琦等，2017）。

中國是農藥生產和使用大國，農藥作為重要的生產資料，在防治有害生物，保障農業生產安全方面發揮了重要的作用，但是長期大量使用農藥也給中國生態環境造成了一定的負面影響（蒲生彥等，2019）。中國農藥管理部門越來越重視農藥對生態環境的安全評價，但是大部分的研究主要著眼于農藥對鳥類、魚類和蜜蜂的負面影響，有關農藥對蚯蚓等土壤動物的影響還未受到足夠的重視（姜錦林等，2014）。近年來，關于農藥對蚯蚓毒性的研究在國內外已有一些報道，但所涉及的品種主要為殺蟲劑和殺菌劑（陳愛梅等，2013；林濤等，2015）。使用的化學農藥中，除草劑占比最大，發達國家除草劑用量占市場上所有農藥用量的 70%以上，并在未來有進一步上升的趨勢（Muthukaruppan et al.，2005）。截至目前，有關除草劑對蚯蚓毒性的研究較少，生產中常用除草劑對蚯蚓毒性還不明確。王彥華等（2012）研究了22種除草劑對蚯蚓的急性毒性，其中的特丁津、莎稗磷、乙草胺、丙草胺和精異丙甲草胺采用濾紙接觸法測定時對蚯蚓表現為中等毒性。林濤等（2015）采用藥土法測定了2, 4-D二甲胺鹽對蚯蚓的急性毒性，表現為低毒。在已發表的有關除草劑對蚯蚓急性毒性的文獻資料中，大部分供試除草劑都是一些較老的品種，在當前的農業生產中已不常用，部分品種甚至已經被禁用如甲磺隆和百草枯等。因此，本研究的目標是：測定當前農業生產中常用的 17種除草劑對蚯蚓的急性毒性，明確除草劑對蚯蚓的劑量-毒性效應關系，為評估除草劑對蚯蚓的生態風險提供數據信息，同時為安全、科學使用除草劑提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 供試除草劑

選擇當前農業生產中廣泛使用的 17種除草劑開展試驗，供試除草劑原藥如下：90%二氯喹啉酸（quinclorac），江蘇省激素研究所股份有限公司生產；96%滅草松（bentazone），安徽豐樂農化有限責任公司生產；95% 2甲4氯鈉（MCPA-Na），江蘇健谷化工有限公司生產；96%噁唑酰草胺（metamifop），安徽眾邦生物工程有限公司生產；95%雙草醚（bispyribac-sodium）、98%吡嘧磺隆（pyrazosulfuron-ethyl），江蘇瑞邦農化股份有限公司生產；98%五氟磺草胺（penoxsulam），美國陶氏益農公司生產；95%嘧啶肟草醚（pyribenzoxim），安徽圣豐生化有限公司生產；97%氰氟草酯（cyhalofop-butyl），江蘇中旗科技股份有限公司生產；98%丙草胺（pretilachlor），山東濱農科技有限公司生產；95%草銨膦（glufosinate ammonium），利爾化學股份有限公司生產；97%高效氟吡甲禾靈（haloxyfop-R-methyl）、95%乙羧氟草醚（fluoroglycofen），江蘇長青農化股份有限公司生產；96%二甲戊靈（pendimethalin），山東天成生物科技有限公司生產；97%苯唑草酮（topramezone），巴斯夫歐洲公司生產；97%硝磺草酮（mesotrione），江蘇豐山集團股份有限公司生產；95%煙嘧磺隆（nicosulfuron），江蘇龍燈化學有限公司生產。所有供試除草劑原藥均從市場購買獲得。

1.2 供試蚯蚓

供試蚯蚓為赤子愛勝蚓（Eisenia fetida），由上海瀛西果蔬專業合作社提供。試驗開始前先在室內裝有土的周轉箱中預養15 d（20—25 ℃，相對濕度60%—70%）。挑選大小一致且環帶明顯的健康蚯蚓開展試驗，蚯蚓個體質量400—500 mg。按照Fründ et al.（2010）推薦的方法檢查蚯蚓的健康狀態。

1.3 試驗方法

1.3.1 濾紙接觸法

參照歐洲共同體推薦的濾紙接觸法（OECD，1984），并略做改進（用培養皿代替了平底玻璃管），開展試驗。在直徑10 cm的培養皿中，內置一層相同直徑大小的濾紙。每個培養皿添加2 mL用丙酮溶解配制的藥液，并放置在通風櫥中24 h，待丙酮完全揮發后加入2 mL蒸餾水潤濕濾紙，同時加入1條蚯蚓。蚯蚓加入前先被置于濕潤的濾紙上清腸24 h（20 ℃，全黑），以排空其腸道內容物。將添加了藥液和蚯蚓的培養皿置于20 ℃，相對濕度75%的人工氣候箱（MLR-352H，Sanyo Electric Co.，Ltd.，Osaka，Japan）中黑暗培養，分別于24 h和48 h調查并記錄蚯蚓死亡數，以蚯蚓前尾部對機械刺激無反應視為死亡。死亡率按照下式計算：

式中：

P為死亡率；

Pt為處理組死亡率；

C為對照組死亡率。當對照組死亡率低于10%時為有效測定數據。

正式試驗之前，先進行了選擇藥劑有效濃度范圍的預試驗，求出每個供試藥劑對蚯蚓全致死的最低濃度和全存活的最高濃度，并在此范圍內設置正式試驗的濃度。每個藥劑設置5個濃度，以添加丙酮的處理為對照。10條蚯蚓為一組，并視為1次重復，整個試驗重復3次。

1.3.2 人工土壤法

參照歐洲共同體推薦的標準方法配制人工土壤（Oecd，1984）。人工土壤由10%泥炭蘚、20%高嶺土、69%石英砂和 1%碳酸鈣組成。將供試除草劑原藥用丙酮溶解后拌于10 g石英砂中，待丙酮完全揮發后與490 g人工土壤充分混勻，加入蒸餾水調節人工土壤含水量至35%。將含有藥劑的人工土壤裝入1250 mL的黑色帶蓋塑料盒中，每個塑料盒添加10條預先在人工土壤中馴養并清腸24 h的蚯蚓。塑料盒蓋上鉆有通氣孔，便于氣體交換。塑料盒置于20 ℃，相對濕度75%的人工氣候箱中光照黑暗各12 h培養（光照強度400—800 lx）。分別于7 d和14 d調查蚯蚓死亡數，計算死亡率。死亡判斷標準和死亡率計算公式同濾紙接觸法。

正式試驗之前，先進行了選擇濃度范圍的預試驗，通過設置 0.1、1、10、100、1000 mg·kg?15個質量分數，以確定導致蚯蚓 0—100%死亡率的濃度范圍。并根據確定的濃度范圍，每個藥劑設置5—7個供試濃度，每個濃度設置3次重復，以添加丙酮的人工土壤為對照。

1.4 數據處理

試驗所得數據采用DPS 7.5統計軟件進行處理，以供試除草劑濃度的對數值和蚯蚓死亡率的幾率值進行回歸分析，計算半數致死濃度（median lethal concentration，LC50）、95%置信限和相關系數r。濾紙接觸法測定的毒性分級標準為（Roberts et al.，1984）：LC50≤1.0 μg·cm?2，劇毒；1.0 μg·cm?21000.0 μg·cm?2，微毒。人工土壤法測定的毒性分級采用 GB/T 31270.15—2014化學農藥環境安全評價試驗準則第15部分：蚯蚓急性毒性試驗（中華人民共和國農業部，2014）中提出的標準：LC50≤0.1 mg·kg?1，劇毒；0.110.0 mg·kg?1，低毒。

2 結果與分析

采用濾紙接觸法和人工土壤法開展試驗期間，丙酮對照組的蚯蚓生長正常，未見死亡，表明本試驗數據合理有效。

2.1 濾紙接觸法測定結果

濾紙接觸法測定結果見表 1。研究表明，除草劑對赤子愛勝蚓的毒性與除草劑品種及染毒時間有關。赤子愛勝蚓與除草劑接觸后，部分處理的蚯蚓出現身體卷曲（圖1a、b）、體節腫大充血（圖1c、d）、身體斷裂糜爛等癥狀（圖1e、f）。濾紙接觸法染毒24 h調查，噁唑酰草胺對赤子愛勝蚓的毒性最高，LC50為 9.9 μg·cm?2，屬高毒級；其次為丙草胺、高效氟吡甲禾靈、滅草松，LC50分別為 14.8、33.3、73.4 μg·cm?2，屬中毒級；再次為二氯喹啉酸、2甲4氯鈉、苯唑草酮、雙草醚，LC50分別為 161.8、252.4、266.4、908.3 μg·cm?2，屬低毒級；煙嘧磺隆、草銨膦、二甲戊靈、乙羧氟草醚、吡嘧磺隆、氰氟草酯、五氟磺草胺、硝磺草酮、嘧啶肟草醚對赤子愛勝蚓的 LC50均大于1000.0 μg·cm?2，屬微毒級。隨著染毒時間的延長，供試除草劑對赤子愛勝蚓的毒性有所增加。濾紙接觸法染毒48 h調查，噁唑酰草胺對赤子愛勝蚓的毒性依然最高，LC50為 7.6 μg·cm?2，屬高毒級；其次為丙草胺、高效氟吡甲禾靈、滅草松，LC50分別為 10.7、12.7、61.3 μg·cm?2，屬中毒級；再次為二氯喹啉酸、2甲4氯鈉、苯唑草酮、草銨膦、雙草醚，LC50分別為143.0、198.2、211.1、466.9、649.2 μg·cm?2，屬低毒級；二甲戊靈、乙羧氟草醚、吡嘧磺隆、氰氟草酯、五氟磺草胺、硝磺草酮、嘧啶肟草醚對赤子愛勝蚓的 LC50均大于 1000.0 μg·cm?2，屬微毒級。

圖1 除草劑對赤子愛勝蚓的形態異常特征Fig. 1 Morphological abnormalities of the herbicides on Eleusine fetida

表1 采用濾紙接觸法測定的除草劑對赤子愛勝蚓的急性毒性Table 1 Acute toxicity of herbicides to Eisenia fetida by using filter paper contact test

2.2 人工土壤法測定結果

人工土壤法測定結果見表 2。與濾紙接觸法測定的結果類似，采用人工土壤法測定時，不同除草劑對赤子愛勝蚓的毒性同樣與除草劑品種及染毒時間有關。人工土壤法染毒7 d調查，高效氟吡甲禾靈對赤子愛勝蚓的毒性最高，LC50為181.6 mg·kg?1；其次為 2甲 4氯鈉、丙草胺、二甲戊靈、煙嘧磺隆，LC50分別為 340.3、423.1、480.3、754.5 mg·kg?1；二氯喹啉酸、滅草松、噁唑酰草胺、雙草醚、乙羧氟草醚、苯唑草酮、草銨膦、吡嘧磺隆、氰氟草酯、五氟磺草胺、硝磺草酮和嘧啶肟草醚對赤子愛勝蚓的毒性相對較低，LC50均大于 800.0 mg·kg?1。隨著染毒時間的延長，供試除草劑對赤子愛勝蚓的毒性有所增加。人工土壤法染毒14 d調查，高效氟吡甲禾靈對赤子愛勝蚓的毒性依然最高，LC50為 148.9 mg·kg?1；其次為丙草胺、2甲 4氯鈉、二甲戊靈、噁唑酰草胺、苯唑草酮、滅草松、煙嘧磺隆、二氯喹啉酸和嘧啶肟草醚，LC50分別為 211.5、335.0、342.4、345.7、573.3、649.5、703.1、715.0、743.6 mg·kg?1；雙草醚、乙羧氟草醚、草銨膦、吡嘧磺隆、氰氟草酯、五氟磺草胺和硝磺草酮對赤子愛勝蚓的毒性相對較低，LC50均大于 800.0 mg·kg?1。根據《化學農藥環境安全評價試驗準則》中的分級標準，采用人工土壤法測定的 17種除草劑對赤子愛勝蚓的毒性等級均為低毒級。

表2 采用人工土壤法測定的除草劑對赤子愛勝蚓的急性毒性Table 2 Acute toxicity of herbicides to Eisenia fetida by using artificial soil test

3 討論

急性毒性試驗對評估化學品對蚯蚓的生態風險具有重要的作用。據Heimbach（1992）報道，急性毒性試驗的結果與實際觀察到的影響之間具有較好的相關性。開展除草劑對蚯蚓的急性毒性試驗，可以快速對除草劑的毒性做出初步的判斷。測定蚯蚓急性毒性的方法很多，例如濾紙接觸法、人工土壤法、飼喂法、注射法、浸入法、點滴法、強迫攝食法和自然土壤法（Wang et al.，2012a），其中濾紙接觸法和人工土壤法受到的關注最多，并被OECD列為開展化學品對蚯蚓急性毒性試驗的標準方法（OECD，1984）。濾紙接觸法易操作、速度快、可重復性好，反映了除草劑對蚯蚓的經皮毒性，常作為預試驗或應急預警的試驗方法（Tripathi et al.，2010）。人工土壤法模擬了蚯蚓生活的自然環境，測定結果較客觀，反映了除草劑被蚯蚓腸道吸收后的毒性（Udovic et al.，2010）。本研究同時采用濾紙接觸法和人工土壤法開展試驗，可以更全面地了解供試除草劑對蚯蚓的毒性。

除草劑是全世界使用量最大的農藥類別，蚯蚓死亡率與除草劑使用之間的關系仍不明確。以往的研究表明，有些除草劑對蚯蚓有直接毒性，而有些除草劑則沒有影響（Zarea et al.，2012）。現代除草劑的創制朝著高效、低毒的方向發展，除草劑對蚯蚓的毒性一般較低，但也有一些例外。本研究結果進一步驗證了上述結論，本次測定，不同除草劑之間對蚯蚓的毒性差異較大。采用濾紙接觸法測定，噁唑酰草胺對赤子愛勝蚓屬高毒級；丙草胺、高效氟吡甲禾靈和滅草松對赤子愛勝蚓屬中毒級；二氯喹啉酸、2甲 4氯鈉、苯唑草酮、草銨膦、煙嘧磺隆和雙草醚對赤子愛勝蚓屬低毒級；吡嘧磺隆、五氟磺草胺、嘧啶肟草醚、氰氟草酯、乙羧氟草醚、二甲戊靈和硝磺草酮屬微毒級。采用人工土壤法測定，高效氟吡甲禾靈對赤子愛勝蚓毒性最高；其次為丙草胺、2甲 4氯鈉、二甲戊靈和噁唑酰草胺；人工土壤法測定的17種除草劑對赤子愛勝蚓均為低毒級。王彥華等（2012）采用濾紙接觸法和人工土壤法測定了草銨膦、丙草胺、氰氟草酯對赤子愛勝蚓的急性毒性，測定結果與本研究一致。

除草劑對蚯蚓的毒性結果與測定方法的選擇有關。濾紙接觸法中，除草劑黏附在濾紙表面，蚯蚓通過體表直接接觸藥劑，對藥劑的吸收量大，吸收速率快。人工土壤法中，藥劑被土壤膠體和有機質吸附，受環境的影響，還會發生降解，從而降低了蚯蚓對藥劑的吸收（Saxena et al.，2014）。本研究同時采用濾紙接觸法和人工土壤法測定除草劑對赤子愛勝蚓的毒性，結果雖然略有不同，但整體趨勢一致。無論是采用濾紙接觸法還是人工土壤法，噁唑酰草胺、高效氟吡甲禾靈、丙草胺、滅草松和2甲4氯鈉對赤子愛勝蚓均表現出相對較高的毒性。Wang et al.（2012b）研究表明，不同化學結構的農藥對蚯蚓的毒性差異較大。本次測定，濾紙接觸法中毒性最高的噁唑酰草胺和人工土壤法中毒性最高的高效氟吡甲禾靈，從化學結構看都屬于芳氧苯氧基丙酸酯類除草劑，該類除草劑可能對蚯蚓具有相對較高的毒性。

近年來，在上海都市農業中，種植戶為了增加土壤中蚯蚓的數量，開始實施和推廣往農田接種蚯蚓的作法，接種蚯蚓后的農田，如何安全使用除草劑，是種植戶最關心的問題之一。本研究可為接種蚯蚓的農田安全使用除草劑提供技術指導。本研究僅測定了除草劑對蚯蚓的急性毒性效應。事實上，在自然的土壤環境中常存在多種除草劑長期低劑量暴露，其對蚯蚓的生態風險不容忽視（王飛菲等，2014）。下一步需要更多地研究多種除草劑聯合暴露對蚯蚓的毒性效應，以便進行充分的生態風險評估。

4 結論

除草劑是全世界使用量最大的農藥類別，開展除草劑對蚯蚓的生態風險評估意義重大。本研究測定的 17種除草劑，大部分對蚯蚓的毒性較低，但不同除草劑之間差異較大。采用濾紙接觸法試驗，噁唑酰草胺對赤子愛勝蚓屬高毒級；丙草胺、高效氟吡甲禾靈和滅草松屬中毒級；二氯喹啉酸、2甲 4氯鈉、苯唑草酮、草銨膦、煙嘧磺隆和雙草醚屬低毒級；吡嘧磺隆、五氟磺草胺、嘧啶肟草醚、氰氟草酯、乙羧氟草醚、二甲戊靈和硝磺草酮屬微毒級。采用人工土壤法試驗，高效氟吡甲禾靈對赤子愛勝蚓的急性毒性最高；其次為丙草胺、2甲 4氯鈉、二甲戊靈、噁唑酰草胺、苯唑草酮和滅草松。采用人工土壤法測定的17種除草劑對赤子愛勝蚓均為低毒級。本研究可為評估除草劑對蚯蚓的生態風險提供新的數據信息，同時可為農業生產中安全使用除草劑提供技術指導。