星形膠質細胞線粒體作為缺血性腦卒中治療靶點的探討

蘇曉梅 張丹參

摘 要：缺血性腦卒中是中老年常見的急性腦血管病，是當今世界主要的致死性疾病之一。現(xiàn)有治療方案有限，僅適用于一小部分中風患者。因此，開發(fā)有效的治療方法以減少腦損傷至關重要。星形膠質細胞（astrocyte，AS）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的核心組成部分，其線粒體功能障礙是缺血性腦卒中的初始事件，在神經(jīng)元存活和神經(jīng)功能改善過程中發(fā)揮著重要作用。以AS細胞線粒體在缺血性腦卒中發(fā)病中的作用機制為切入點，分析討論了缺血性腦卒中發(fā)生時AS細胞線粒體的生物能量與動力學變化、細胞之間線粒體的轉移以及AS細胞線粒體對腦血流的調節(jié)作用，提出將AS細胞線粒體作為治療缺血性腦卒中的靶點之一，以更好地了解AS細胞線粒體在缺血誘導的神經(jīng)元死亡過程中的重要作用，為缺血性腦卒中的新型治療方案提供理論基礎。

關鍵詞：神經(jīng)生物化學;星形膠質細胞;線粒體;缺血性腦卒中;腦損傷

中圖分類號：TQ464.51;R963?? 文獻標識碼：A

doi：10.7535/hbkd.2021yx04010

收稿日期：2021-04-13;修回日期：2021-05-21;責任編輯：王淑霞

基金項目：河北省重點研發(fā)計劃項目（20372509D）;河北省自然科學基金（H2020208032）;河北省高等學校科學技術研究項目（ZD2020117）;河北省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研計劃項目（2020268）;中央財政公共衛(wèi)生專項“中藥資源普查項目”（Z135080000022）

第一作者簡介：蘇曉梅（1991—），女，河北石家莊人，博士研究生，主要從事神經(jīng)藥理學方面的研究。

通訊作者：張丹參教授。E-mail：zhangds2011@126.com

蘇曉梅，張丹參.星形膠質細胞線粒體作為缺血性腦卒中治療靶點的探討[J].河北科技大學學報，2021，42（4）：400-409.SU Xiaomei，ZHANG Danshen.Discussion of astrocytic mitochondria as a therapeutic target for ischemic stroke[J].Journal of Hebei University of Science and Technology，2021，42（4）：400-409.

Discussion of astrocytic mitochondria as a therapeutic target for ischemic stroke

SU Xiaomei1，ZHANG Danshen1，2

（1.Pharmacological Division of Basic Medcical College，Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei 050017，China;2.School of Chemical and Pharmaceutical Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang，Hebei 050018，China）

Abstract：Ischemic stroke is a common acute cerebrovascular disease in the middle-aged and elderly，and one of the most fatal diseases in the world.There are limited treatment options that currently exist and only apply to a small proportion of stroke patients，so developing effective treatments to reduce brain damage is critical.Astrocytes are the core components of the central nervous system.Mitochondrial dysfunction is the initial event of ischemic stroke and plays an important role in neuronal survival and neurological function improvement.In this paper，based on the role of astrocytic mitochondria in the pathogenesis of ischemic stroke，the changes of the biological energy and dynamics of astrocytic mitochondria，the functional transfer to neurons and the regulation of astrocytic mitochondria on cerebral blood flow by astrocytic mitochondrice were discussed.Emphasized that astrocytic mitochondria can be used as one of the targets for the treatment of ischemic stroke，so as to better understand the role of astrocytic mitochondria in the process of ischemia-induced neuronal death，and to provide a theoretical basis for the new treatment of ischemic stroke.

Keywords：

neurobiochemistry;astrocyte;mitochondria;ischemic stroke;brain damage

人類大腦由2類細胞組成，一類是神經(jīng)元，另一類是神經(jīng)膠質細胞。神經(jīng)膠質細胞的數(shù)量約為神經(jīng)元的10倍，神經(jīng)膠質細胞在神經(jīng)元之間充當填充物，同時為神經(jīng)元提供營養(yǎng)。神經(jīng)膠質細胞的主要成員是星形膠質細胞（astrocyte，AS），AS細胞是神經(jīng)網(wǎng)絡的支持基質，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的核心組成部分，具有緩沖細胞外離子、清除氨基酸神經(jīng)遞質、限制興奮性毒性、釋放神經(jīng)遞質、促進突觸發(fā)育等作用，對血腦屏障的完整性和控制神經(jīng)活動至關重要。線粒體是細胞能量來源，其作用包括參與整合細胞功能，調節(jié)Ca2+信號，協(xié)調局部新陳代謝，整合生存、死亡線索等。AS細胞線粒體對缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）有著獨特作用，使AS細胞對缺氧環(huán)境具有彈性和適應性，并且在IS后神經(jīng)元網(wǎng)絡重構中發(fā)揮重要調節(jié)作用。本文分析了缺血期間AS細胞線粒體的生物能量與動力學變化、細胞之間線粒體的轉移以及AS細胞線粒體對腦血流的調節(jié)作用，提出可以通過調節(jié)AS細胞線粒體以對抗缺血性腦卒中，將AS細胞線粒體作為治療缺血性腦卒中損傷的重要靶點。

1 發(fā)病機制概述

腦卒中是由急性發(fā)生的血管或血液異常導致腦部血液循環(huán)障礙而發(fā)生的神經(jīng)功能缺損綜合征，具有高患病率、高復發(fā)率、高致殘率和高死亡率的特點。腦卒中是全球造成死亡和長期致殘的主要原因之一[1]，是中國人死亡的第三大因素，僅次于惡性腫瘤和心臟病[2]，2018年157萬人因腦卒中死亡，占全部死亡人數(shù)的22.33%。臨床上將腦卒中分為缺血性腦卒中、出血性腦卒中和短暫性腦缺血，其中缺血性腦卒中占比高達87%，是腦卒中的主要類型，主要由大腦動脈栓塞引起[3]。大腦血液供應不足會使腦細胞失去必要的葡萄糖和氧氣，擾亂細胞內(nèi)環(huán)境平衡，從而觸發(fā)病理生理過程，包括興奮性氨基酸毒性、氧化應激、炎癥、細胞凋亡和細胞死亡等[4]，并且各種病理機制之間相互關聯(lián)，構成復雜的信號網(wǎng)絡，最終導致級聯(lián)性腦損傷。短時間缺血時，腦組織血液快速恢復，可以減輕神經(jīng)元損傷，使其功能得到一定程度的恢復;若缺血時間過長，神經(jīng)元則出現(xiàn)不可逆損傷，即使血液再灌注也不能促進組織恢復，反而引起繼發(fā)性損傷，因此缺血的有效治療方法是盡快恢復缺血組織的血流量[5]。例如，缺血性腦卒中的標準護理是利用重組組織型纖溶酶原激活劑（re-combinant tissue plasminogen activator，t-PA）溶栓或通過血管造影進行血管重建，清除腦動脈阻塞。但t-PA治療窗較窄，需要在腦卒中后3 h內(nèi)靜脈注射（某些符合條件的患者可延長至4.5 h，且患者必須符合多項選擇標準，臨床上大約只有8%的腦卒中患者接受了t-PA溶栓治療[6]。為了解決目前腦卒中治療方法的不足，開發(fā)新的治療靶點至關重要。

缺血性腦卒中通常是由動脈栓塞或血栓性阻塞造成的腦血流量減少引起的。實驗過程中常用動物的腦缺血再灌注損傷模型模擬缺血性腦卒中，其損傷機制從時間上可分為3個階段：急性缺血帶來的氧分壓降低及能量剝奪、恢復供血后Ca2+超載誘導神經(jīng)炎癥、再灌注后期神經(jīng)細胞死亡[7]。線粒體作為能量代謝的重要細胞器，富含大量酶類，這些酶不僅參與細胞氧化磷酸化和ATP合成，還調節(jié)細胞內(nèi)Ca2+與活性氧（reactive oxygen species，ROS），維持細胞穩(wěn)態(tài)。當缺血性腦卒中發(fā)生時，線粒體維持的動態(tài)平衡被打破，相關信號通路被激活，最終誘導神經(jīng)細胞級聯(lián)性損傷。具體損傷過程如下：腦缺血過程中，神經(jīng)細胞的生物能量減少，使得Na+/K+-ATP酶活性降低，離子穩(wěn)態(tài)失衡，細胞膜去極化，大量Ca2+內(nèi)流，Ca2+超載則引發(fā)神經(jīng)遞質Glu過量釋放，產(chǎn)生興奮性氨基酸毒性;而Glu可以與Glu受體結合進一步促進大量的Ca2+內(nèi)流，造成線粒體功能障礙，導致細胞凋亡;同時在腦梗死過程中，激活巨噬細胞和小膠質細胞，釋放血管活性介質和促炎性細胞因子，促進更多白細胞的浸潤而引發(fā)神經(jīng)炎癥。炎癥細胞也能產(chǎn)生ROS和活性氮，反過來激活炎癥細胞，導致惡性循環(huán);此外，再灌注過程中，恢復血流和氧氣，ROS大量增加引發(fā)氧化應激反應，加重炎癥反應，損傷血腦屏障，導致不可逆的腦組織損傷[8]。可見，線粒體功能障礙是缺血性卒中后的初始事件，并與缺血性腦卒中緊密聯(lián)系，靶向線粒體能減輕缺血性腦卒中的破壞性結果，可作為治療缺血性腦卒中的新方法。綜上所述，線粒體在缺血性腦卒中的不同階段都發(fā)揮重要作用，從ATP的合成障礙到氧自由基的生成與釋放，再到細胞死亡，線粒體的形態(tài)與功能都與腦損傷息息相關。

2 AS細胞線粒體在缺血性腦卒中發(fā)病機制中的重要作用

AS細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富的神經(jīng)膠質細胞，約占腦總體積的50%，其數(shù)量遠遠超過了神經(jīng)元[9]，主要分布于中樞神經(jīng)白質和灰質中。AS細胞與神經(jīng)元之間存在廣泛而復雜的信息傳遞，以直接相互作用的方式與神經(jīng)元發(fā)生聯(lián)系，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、突觸傳遞、調控信息處理與信號傳遞、離子平衡、調節(jié)神經(jīng)和突觸的可塑性等方面都發(fā)揮重要作用[10]。在生理情況下，AS細胞對神經(jīng)元起營養(yǎng)支持作用，在神經(jīng)損傷后，可參與糖、脂肪和體液代謝，具有神經(jīng)營養(yǎng)功能[11];在腦缺血情況下，AS細胞可以儲備糖原，為病理期葡萄糖短缺的神經(jīng)元提供能量，釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進神經(jīng)元再生和修復，維持腦缺血后神經(jīng)功能的完整性和可塑性[12]。

線粒體最早在1890年被描述為“原生體”，隨后人們在1898年發(fā)現(xiàn)了線粒體的各種形態(tài)，有時是球形，有時是細長形，由此產(chǎn)生了線粒體這個名字，線粒體由希臘語單詞“mitos”（線）和“chondrion”（顆粒）2個詞組成[13]。線粒體作為細胞的動力源，在細胞能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關鍵作用，廣泛存在于除哺乳動物成熟紅細胞以外的所有真核細胞中[14]。線粒體的主要作用是通過線粒體電子傳遞鏈（electron transport chain，ETC）氧化磷酸化，以三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的形式產(chǎn)生細胞能量，在氧化應激、鈣平衡、細胞周期與發(fā)育、脂質代謝、信號轉導、細胞凋亡等活動中發(fā)揮重要作用。與其他腦細胞相比，神經(jīng)元有更高的能量需求，但由于能量儲備不足，其更容易受到缺血環(huán)境的影響。AS細胞中的線粒體定位于突觸附近，隨著神經(jīng)元的活動而移動。初步研究證明，線粒體使AS細胞面對缺氧環(huán)境時具有彈性和適應性。在面臨缺血狀態(tài)時，AS細胞線粒體可以發(fā)生生物能量變化和動力學變化，并且可以向神經(jīng)元發(fā)生轉移，調節(jié)腦血流，對缺血后的神經(jīng)細胞發(fā)揮保護作用。因此，靶向AS細胞線粒體可能是一種新的干預方法，可以減輕缺血性腦卒中損傷和改善臨床治療效果。

2.1 缺血時AS細胞線粒體生物能量的變化

線粒體作為細胞的動力源，在細胞能量穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用。當缺血性腦卒中發(fā)生時，大量Na+流入細胞，刺激Na+/Ca2+交換器的反向作用，產(chǎn)生電化學梯度，通過電壓依賴性陰離子通道和線粒體Ca2+單項轉運體，驅動Ca2+在線粒體中大量積累，線粒體通透性轉變孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開放[15]。MPTP開放后允許小分子物質任意通過，破壞離子梯度，線粒體膜電位（Δψm）喪失，嵴出現(xiàn)滲透壓性腫脹，釋放細胞色素c和NADH到AS細胞胞漿中，從而引發(fā)級聯(lián)反應導致細胞凋亡。同時，線粒體Ca2+升高激活三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）脫氫酶，產(chǎn)生大量ROS，導致抗氧化通路失效[16]。反過來，ROS的產(chǎn)生和線粒體膜電位的丟失也可以刺激MPTP開放和線粒體損傷，擾亂ATP合成，能量平衡受到破壞[17]。在再灌注過程中，神經(jīng)元釋放大量的谷氨酸（glutamate，Glu），AS細胞線粒體固定在Glu轉運體和神經(jīng)元突觸附近[18]，促進Glu代謝和ATP的產(chǎn)生，以滿足能量需求，如圖1所示。

雖然普遍認為線粒體膜電位的崩潰可以導致AS細胞不可逆的死亡[19]，但最近研究表明，即使AS細胞經(jīng)歷了嚴重的線粒體去極化和氧化代謝損傷，其仍具有彈性。VOLOBOUEVA等[20]用AS細胞選擇性線粒體呼吸抑制劑氟檸檬酸鹽（fluorocitrate，F(xiàn)C）處理AS細胞2 h，線粒體膜電位在3 h后才出現(xiàn)下降。將神經(jīng)元和AS細胞共培養(yǎng)時，F(xiàn)C的作用更快、更強。然而，線粒體膜電位的嚴重喪失并沒有伴隨著AS細胞的死亡。將AS細胞與神經(jīng)元分別單獨培養(yǎng)，隨后進行氧糖剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）60～70 min，AS細胞表現(xiàn)出更強的抗缺血能力，100%的神經(jīng)元受到不可逆的損傷，隨后細胞死亡，而OGD進行4 h后AS細胞才出現(xiàn)死亡[21]。但當AS細胞與神經(jīng)元共同培養(yǎng)，隨后進行OGD時，AS細胞線粒體去極化速度加快，細胞死亡增加。一種假設是，AS細胞線粒體在OGD過程中經(jīng)歷了早期去極化，從有氧代謝轉為糖酵解，為能量受損的神經(jīng)元提供乳酸鹽，從而防止神經(jīng)元死亡，增加自身死亡。然而，這一過程依賴于AS細胞的糖原儲存過程。因此，需要快速恢復呼吸功能，防止不可逆的中樞神經(jīng)損傷。值得注意的是，體外培養(yǎng)的AS細胞與體內(nèi)的AS細胞有很大不同，體外培養(yǎng)的AS細胞具有單層形態(tài)，缺乏細胞間的突觸和血管接觸[22]，這種形態(tài)學差別是否影響AS細胞線粒體功能，以及一些基于體外培養(yǎng)的細胞是否會對結果產(chǎn)生不同影響，仍需要在體內(nèi)系統(tǒng)中進行驗證。

2.2 缺血時AS細胞線粒體的動力學變化

線粒體是一種高度動態(tài)的細胞器，能夠根據(jù)代謝的需要改變其結構，從形態(tài)各異的單一小結構跨越到多個星狀細胞過程的復雜互聯(lián)網(wǎng)絡[23]。不同條件下，線粒體通過分裂和融合2個相反的過程維持其形態(tài)，并進行成分交換，包括線粒體DNA（mtDNA）、脂質和蛋白質等。分裂過程包括收縮和裂開，可以增加線粒體的數(shù)量和分布，有助于線粒體的更新和再分配[24]。調節(jié)線粒體分裂的蛋白主要有：發(fā)動蛋白相關蛋白1（dynamin-related protein 1，Drpl）和線粒體分裂蛋白1（mitochondrial fission protein 1，F(xiàn)is1）。其中Drpl是分裂的關鍵調控因子，通過幾種受體蛋白從胞質被募集到線粒體外膜，這些受體蛋白包括線粒體動力學蛋白質49，51 kDa（mitochondrial dynamics proteins of 49 and 51 kDa，Mid49和Mid51），F(xiàn)is1/2、線粒體分裂因子（mitochondrial fission factor，Mff）等[25]（見圖2）。融合過程是2個相鄰線粒體的束縛和連接，伴隨線粒體內(nèi)膜和線粒體外膜的合并。受損線粒體可以得到健康線粒體的遺傳物質及維持功能所必須的蛋白質[26];正常情況下，線粒體融合可以通過成分分布和共享管狀網(wǎng)絡增加線粒體的完整性，還可以促進各類細胞內(nèi)信號的傳遞、膜電位的傳導及線粒體脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的互補修復[27]。調節(jié)線粒體融合的蛋白質主要有：線粒體融合蛋白1和線粒體融合蛋白2（mitofusins 1 and 2，Mfn1/2）、視神經(jīng)萎縮相關蛋白1（optic atrophy 1，Opa1）等[28]（見圖2）。

分裂與融合具有既互補又獨立的特性，分裂和融合的相對比率決定了細胞的形狀、分布和網(wǎng)絡結構。正常情況下，分裂和融合同時進行且速度基本相同，從而保持穩(wěn)定的細胞形態(tài)和功能。線粒體動力學對細胞存活和死亡的調節(jié)非常重要，線粒體分裂是腦缺血后神經(jīng)元死亡的早期上游事件[29]。研究報道，線粒體在細胞凋亡前，分解成多個小單位，阻礙線粒體分裂，阻止細胞色素c的釋放和延緩細胞死亡。已有研究表明，Drp1在缺血性腦卒中發(fā)揮重要作用，線粒體氧化應激過程中，Drp1表達上調，導致線粒體分裂和融合失衡，線粒體功能障礙和解體，最終細胞死亡[30]。使用抗氧化劑如維生素E或MitoQ可降低Drp1的表達，減少線粒體分裂[31]。相反，敲低Drp1基因使得線粒體產(chǎn)生的ROS減少[32]。此外，下調Drp1蛋白水平還可以減小梗死體積[33]。體外研究表明，對于Drp1突變細胞系，其線粒體分裂和凋亡細胞死亡顯著減少[34]。因此，Drp1不僅對線粒體分裂至關重要，對細胞命運也至關重要。然而在缺血性腦卒中過程中，關于線粒體融合蛋白的研究較少，在缺氧模型中發(fā)現(xiàn)，Mfn2的表達減少，并且Mfn2可能通過恢復線粒體功能發(fā)揮抗凋亡作用[35]。有報道稱，在腦缺血損傷中，運動可增加Opa1的表達，從而減輕腦水腫[36]。線粒體融合的潛在益處，尤其是增強Mfn2的表達，在腦缺血中的作用仍有待闡明。線粒體在腦缺血疾病中發(fā)揮重要作用，可以通過調節(jié)線粒體分裂和融合過程中的相關蛋白，改善缺血性腦卒中造成的神經(jīng)元損傷。

線粒體分布于AS細胞整個細胞體最細的分支和末梢，細長的線粒體通常見于胞體和主要的分支內(nèi)，而長度在0.2～6.0 μm之間的細短線粒體主要分布于外圍，包括外周神經(jīng)突起[37]。OWENS等[38]利用熒光標記線粒體的轉基因小鼠作為模型，考察雙側頸總動脈阻塞和低血壓引起的短暫性腦缺血過程中AS細胞和神經(jīng)元的線粒體形態(tài)學變化。結果表明，在缺血早期，神經(jīng)元的線粒體變小，形狀接近球形，管狀線粒體開始減少，表明分裂增加;隨后，部分球狀線粒體出現(xiàn)腫脹，發(fā)生不可逆的膜破裂，幾天后可見熒光染料滲漏到細胞質中。相似地，AS細胞線粒體的球形亞群增加，在恢復氧氣和葡萄糖2 h后，相應的管狀線粒體明顯減少，表明分裂增加;然而，與神經(jīng)元不同的是，在復氧4 h后，AS細胞中的管狀線粒體增加，表明融合增強。此外，在持續(xù)缺血24 h情況下，AS細胞線粒體仍然形態(tài)正常，沒有明顯分裂，與對照組相比，桿狀及管狀正常線粒體所占比例無顯著差異。研究顯示，當線粒體受到氧化損傷時，其形態(tài)會從桿狀或管狀變?yōu)榍驙罨颦h(huán)狀，破壞線粒體表面積和體積比，改變線粒體基質蛋白或DNA的正常分布，以及線粒體呼吸鏈復合體的正常分布，最終影響線粒體的呼吸功能[39-40]。實驗中，實驗組與對照組AS細胞正常線粒體所占比例相同，表明與神經(jīng)元相比，AS細胞線粒體動態(tài)修復能力更強，可以從缺血應激中恢復，防止細胞死亡。這是由于AS細胞內(nèi)在的線粒體特性，還是由于AS細胞與神經(jīng)元對缺血的負荷不同，目前尚不清楚。

然而，缺血時線粒體網(wǎng)絡的動態(tài)重構可能提供了一種適應性機制來維持線粒體和細胞功能。Glu可能在這一過程中起關鍵作用，激活AS細胞Glu轉運體可以導致AS細胞過程中的線粒體阻滯[41]。因此，在缺血損傷時神經(jīng)元釋放的Glu可能是AS細胞線粒體網(wǎng)絡動力學的主要調控因子，其能促進AS細胞存活，對鄰近神經(jīng)元發(fā)揮保護和修復作用，降低不可逆的損傷程度。

2.3 缺血時AS細胞線粒體的轉移

與神經(jīng)元不同的是，AS細胞可以通過糖酵解產(chǎn)生ATP，使AS細胞在面對低氧血癥和低血糖時具有彈性[42]。使用線粒體呼吸鏈功能必需的Cox10基因誘導小鼠AS細胞線粒體功能障礙，結果表明有呼吸缺陷的AS細胞可以長期存活，且表型和功能正常[43]，但不能維持正常的局部組織和功能[44]。與正常AS細胞相比，基因靶向的AS細胞盡管呼吸鏈功能丟失，但線粒體數(shù)量和形態(tài)未發(fā)生改變，且腦內(nèi)乳酸增加，證明AS細胞單靠延長糖酵解時間可以存活，且缺氧后，AS細胞可以為鄰近神經(jīng)元提供能量底物（即乳酸）。

AS細胞除了通過乳酸穿梭為神經(jīng)元提供能量基質外，還可以直接為神經(jīng)元提供功能性的線粒體，將神經(jīng)元從缺血性損傷中拯救出來。線粒體轉移是一種保護機制，針對應激級聯(lián)反應，拯救線粒體功能障礙的受損細胞。細胞間囊泡和細胞器可以通過隧道納米管或細胞外囊泡進行交換[45-46]，從相鄰的健康線粒體轉移到含有受損線粒體的細胞。HAYAKAWA等[47]報道了在小鼠局灶性腦卒中模型和體外培養(yǎng)的AS細胞OGD處理后，AS細胞可以通過CD38依賴機制將功能性線粒體轉移到神經(jīng)元中，該過程中細胞外線粒體的生成涉及原代皮質AS細胞產(chǎn)生的囊泡或顆粒。在體外實驗中，將培養(yǎng)的皮質神經(jīng)元經(jīng)OGD處理后，加入AS細胞培養(yǎng)液（astrocyte-conditioned medium，ACM），受損神經(jīng)元的ATP水平得以恢復，細胞活性增強。用膜電位依賴性熒光染料MitoTracker Red CMXRos熒光標記ACM中囊泡內(nèi)的線粒體，將含線粒體的ACM加入到OGD損傷后的神經(jīng)元中，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元內(nèi)可以檢測到AS細胞線粒體，如果從ACM中去除細胞外線粒體，則該神經(jīng)保護作用消失。同樣，在體內(nèi)實驗中，將從ACM收集的熒光標記的細胞外線粒體顆粒注射到小鼠梗死周圍皮質，24 h后觀察到相鄰神經(jīng)元內(nèi)存在熒光標記的AS細胞線粒體，并且神經(jīng)元細胞存活相關信號普遍上調，線粒體標志物增加。

在此過程中，將功能性的AS細胞線粒體轉移到神經(jīng)元中的關鍵是CD38基因，CD38缺陷小鼠在腦損傷后表現(xiàn)出功能恢復受損，并且CD38突變也是行為功能障礙的危險因素[48]。用siRNA-介導敲低CD38，體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中AS細胞線粒體的熒光強度顯著降低，神經(jīng)元內(nèi)線粒體密度降低，表明AS細胞線粒體向受損神經(jīng)元的轉移減少。在體敲除CD38基因并沒有改變總的梗死面積，但使得神經(jīng)元線粒體數(shù)量減少，表明AS細胞-神經(jīng)元轉移可能受損，該結果在小鼠體內(nèi)局灶性腦缺血模型中也得到驗證，表明CD38活性對AS細胞支持神經(jīng)元的功能非常重要。然而，當使用高濃度熒光染料時，有破壞線粒體網(wǎng)絡的可能，并從標記細胞中泄漏出來，在懸液中形成熒光微粒，未來對小鼠的研究使用基因方法跟蹤和確認線粒體轉移，應繞過線粒體染料的毒性問題。

轉移過程中，引導線粒體從AS細胞釋放并進入神經(jīng)元的特定細胞信號通路，以及細胞外囊泡的傳導機制，仍有待進一步闡明。目前，沒有證據(jù)可以表明含有線粒體的囊泡可以直接將線粒體釋放到相鄰細胞的細胞質中，如果含有線粒體的微粒通過神經(jīng)元進行常規(guī)內(nèi)吞作用，則可能會激活破壞囊泡的內(nèi)吞途徑，因此不太可能釋放功能性線粒體。故有一種假設，包含線粒體的ACM囊泡，僅與神經(jīng)元連接，而不存在于細胞內(nèi)。如果ACM中的微粒附著于表面，而沒有直接將線粒體轉移到神經(jīng)元中，那么ACM中的微粒利用自身代謝活性，將釋放或轉移小分子物質[49]。其具體過程為：AS細胞與神經(jīng)元之間的縫隙連接介導線粒體微粒與質膜連接，從而導致通道形成，小分子物質可以通過AS細胞線粒體微粒和神經(jīng)元質膜上存在的縫隙連接蛋白-43（connexin-43，Cx43）半通道，擴散進入受損神經(jīng)元（見圖3 B）。在MCAO大鼠模型中，注射外源性線粒體被神經(jīng)元、AS細胞和小膠質細胞攝取，改善了線粒體功能，提高了大鼠的運動能力[50]。通過線粒體轉移恢復失衡的線粒體動力學，可能是一種減輕由腦卒中引起神經(jīng)元死亡的潛在方法。

此外，受損細胞的線粒體也能向健康細胞轉移，研究報道野生小鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸突在視神經(jīng)頭（optic nerve head，ONH）脫落線粒體，轉移至相鄰的AS細胞進行內(nèi)吞和降解，這一過程被稱為轉移線粒體自噬（見圖3 A），該現(xiàn)象也可能發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的其他位置，因為在大腦皮層的表層中神經(jīng)軸突周圍積累了結構相似的降解線粒體[51]，打破了神經(jīng)元或其他細胞必須自身降解線粒體的假設。短暫缺血狀態(tài)下，神經(jīng)元將損傷的線粒體轉移至AS細胞進行降解，可以對神經(jīng)元發(fā)揮一定程度的保護作用;相反，不受控制的自噬可能導致神經(jīng)元線粒體無限降解和死亡。因此，嚴格控制線粒體轉移自噬機制對于維持健康的線粒體網(wǎng)絡至關重要。

2.4 缺血時AS細胞線粒體對腦血流的調節(jié)作用

AS細胞是腦內(nèi)最豐富的膠質細胞，AS細胞粗大突起末端膨大成終足，貼附于毛細血管外周形成膠質膜，包繞了毛細血管85%的表面[52]，從而加強了對血腦屏障的調節(jié)作用并在腦血液循環(huán)動態(tài)調節(jié)中發(fā)揮重要作用。AS細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)起結構支持作用，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元及其突起間的空隙幾乎全部由AS細胞充填，這樣有益于膠質分離、維持血管、神經(jīng)元胞體、軸突及突觸之間結構的穩(wěn)定，AS細胞在維持腦微血管內(nèi)皮細胞的特異性功能、神經(jīng)元的正常功能、促進蛋白聚糖合成和維持血腦屏障的完整性等方面起到重要作用[53]。AS細胞以終足與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中其他類型細胞相接觸，包括微動脈、毛細血管，組成神經(jīng)血管單元，構成神經(jīng)膠質-血管系統(tǒng)網(wǎng)狀結構[54]，成為神經(jīng)元網(wǎng)絡和血管網(wǎng)絡之間的橋梁，發(fā)出各種調節(jié)信號，聯(lián)系神經(jīng)元和血管系統(tǒng)[55]。

AS細胞可以通過影響血管直徑調節(jié)血流，具體過程如圖4所示。神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質Glu，AS細胞受體激活，調節(jié)轉運體攝取，啟動細胞內(nèi)Ca2+信號，傳遞到AS細胞終足。終足上的Ca2+信號刺激血管活性因子（包括一氧化氮、前列腺素、花生四烯酸代謝物、腺苷等）釋放到大腦血管上[56]，引起血管擴張，從而增加血流量，滿足神經(jīng)元代謝需求。研究表明，刺激誘發(fā)AS細胞和血管終足的Ca2+信號，可以引起體內(nèi)血管直徑的變化[57]。Ca2+信號的強度也是血管反應極性的決定因素，其中AS細胞Ca2+的中度升高可引起血管舒張，而大量升高則可引起血管收縮[58]。此外，在體外試驗中，氧氣含量也可以調節(jié)血管收縮或擴張，高氧含量（95% O2，5% CO2）導致海馬和新生皮層的AS細胞內(nèi)Ca2+釋放，引起血管收縮;而低氧含量（20% O2，5% CO2）則使管徑改變變?yōu)閿U張。血氧含量的調節(jié)是通過細胞外乳酸濃度來改變特定的AA代謝物水平。總之，AS細胞終足可以通過形成Ca2+瞬變和釋放血管活性脂質，引起周圍小動脈直徑的擴張或收縮。

另一種調節(jié)血管直徑的方法是通過AS細胞線粒體調節(jié)Ca2+信號。有證據(jù)表明AS細胞線粒體通過神經(jīng)血管耦合發(fā)揮作用，用氟代檸檬酸選擇性抑制AS細胞線粒體烏頭酸酶，引起大鼠視網(wǎng)膜小動脈張力的喪失[59]。線粒體既是Ca2+的來源，也是Ca2+緩沖器，此外還調節(jié)Ca2+瞬變的空間限制和動力學。當OGD后AS細胞過程中線粒體丟失時，AS細胞遠端的自發(fā)Ca2+信號顯著增加[60]。這些數(shù)據(jù)表明線粒體在AS細胞中促進Ca2+信號的形成。Ca2+瞬變也由線粒體產(chǎn)生，提示線粒體是Ca2+增加的潛在來源。此外，抑制MPTP藥物開放可以引起Ca2+瞬變減少35%，應用神經(jīng)元激活劑可以增加其數(shù)量和頻率。在電鏡研究中，通過使用基因編碼的線粒體定位熒光蛋白對AS細胞線粒體進行標記，結果表明AS細胞線粒體富集于終足包圍的血管中[61]，即AS細胞-血管界面位點，可以調節(jié)對神經(jīng)血管耦合至關重要的Ca2+信號，但AS細胞線粒體在反應中的作用機制仍需進一步研究。

此外，TAKANO等[62]指出，AS細胞控制大腦血液局部微循環(huán)，控制著突觸傳遞和神經(jīng)血管系統(tǒng)的偶聯(lián)[63]，一個AS細胞的突起能與數(shù)萬個突觸相接觸，而且還有其他突起的末梢停留在毛細血管和小動脈上。AS細胞突起末梢中Ca2+的變化能引起小動脈擴張或收縮，從而控制大腦微循環(huán)。除了對血管系統(tǒng)的作用外，AS細胞能調節(jié)神經(jīng)元的整合作用，并與神經(jīng)元的功能相協(xié)調。大腦的正常功能依賴于氧和葡萄糖的供應，而各種神經(jīng)血管控制機制保證腦部足夠的血液供應。所以，AS細胞能感知神經(jīng)元的活動，也可以說，神經(jīng)元活動能控制腦中微循環(huán)是依靠AS細胞作為中介完成的。

許多早期的線粒體研究主要集中在生物能量作用上。然而，近幾十年來，由于動物模型、成像技術方法的進步，人們對線粒體功能的認識發(fā)生了變化，意識到細胞器在細胞功能和信號事件中的重要性，包括與腦血管疾病相關的功能，如凋亡信號、線粒體生物發(fā)生、線粒體動力學、線粒體自噬和質量控制，以及在免疫中的新作用。由于神經(jīng)元突觸和樹突中需要大量線粒體，干細胞可以作為外源性健康線粒體的供體，因此干細胞治療成為缺血性腦卒中靶向線粒體的一種替代方法。一些報告顯示，利用干細胞作為疾病的治療劑，在線粒體功能障礙中可發(fā)揮重要作用。干細胞可以通過隧道納米管、細胞外囊泡或簡單的細胞融合將線粒體轉移到損傷細胞，細胞間線粒體轉移可恢復線粒體功能，放大細胞存活信號，重組分化細胞，有助于恢復受體細胞的細胞活力。近年來，在心肌缺血損傷的患者中，線粒體移植已獲得成功，研究人員應將重點放在利用干細胞治療缺血性腦卒中上。然而，線粒體轉移的臨床實施仍面臨挑戰(zhàn)，未來仍需要進一步研究。

3 結 語

缺血性腦卒中是中老年常見的急性腦血管病，無論是在發(fā)達國家還是在發(fā)展中國家，腦卒中都是當今世界主要的致死性疾病之一。腦卒中在中國具有“高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率、高復發(fā)率、高經(jīng)濟負擔”5大特點。目前的溶栓治療方案僅適用于一小部分中風患者，因此，開發(fā)有效的治療方法減少腦損傷至關重要。AS細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細胞類型，具有營養(yǎng)、支持和調節(jié)神經(jīng)元活動的作用。其中，AS細胞線粒體在缺血性腦卒中病理過程中發(fā)揮著獨特作用。缺血時，AS細胞線粒體的生物能量和動力學會發(fā)生變化，功能性線粒體向神經(jīng)元發(fā)生轉移，并對腦血流進行調節(jié)，進而修復受損的神經(jīng)元。AS細胞線粒體的保護機制，為缺血性腦卒中治療藥物的開發(fā)提供了理論基礎。

目前對AS細胞線粒體的理解是初步的，未來的研究方向主要包括以下幾個方面：

1）比較大腦不同區(qū)域的周圍半暗區(qū)和梗死核心區(qū)，在缺血情況下線粒體的動力學和網(wǎng)絡結構特征。

2）深入探究供體細胞釋放線粒體和受體細胞識別線粒體的主要機制。

3）AS細胞作為逆轉缺血性腦卒中損傷的關鍵，需要明確相關的治療靶點。在線粒體動力學變化過程中，調節(jié)線粒體分裂和融合的相關蛋白、線粒體運輸過程中的肌動蛋白重鏈（KHC）以及作為馬達適配器的Miro和milton，均可以作為AS細胞線粒體的治療靶點。

4）以探討AS細胞線粒體在缺血時對神經(jīng)元的保護作用為切入點，全方位評價AS細胞線粒體在缺血性腦卒中的作用，以期為缺血性腦卒中的治療提供思路和理論基礎。

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