李 浩 徐 瑞 施輝能 劉春蘭 龍光強 田 洋 范 偉
(1云南農業大學資源與環境學院,云南 昆明 650201;2云南農業大學食品科學技術學院,云南 昆明 650201;3 云南農業大學西南中藥材種質創新與利用國家地方聯合工程研究中心/云南省藥用植物生物學重點實驗室,云南 昆明 650201)
瑪咖(Lepidium meyeniiWalp.)是十字花科獨行菜屬一年至二年生草本植物[1],原產于秘魯安第斯山脈中部4 000~4 500 m 的“Puna”農業生態區,在當地有“秘魯人參”和“南美人參”的美譽[2]。瑪咖地下膨大的貯藏根富含瑪咖酰胺類化合物和瑪咖烯等活性成分[3],在強精力、抗疲勞、改善性功能和治療女性更年期綜合癥方面具有顯著的功效[4-5]。自2002年引入我國后,經不同區域的馴化栽培和多年的比較試驗后發現,云南麗江和會澤高海拔地區被認為是中國最適宜瑪咖種植的產區[6-9]。2011年瑪咖被我國批準為新資源食品后,開始在上述兩大區域大面積種植。然而,生產上長期缺乏優質的種源、規范的種植模式和合理的施肥指導,導致瑪咖產量和質量不穩定,產品功效難以保障。
“3414”試驗能夠依據土壤肥力、作物需肥規律和肥料效應函數,確定合理的氮磷鉀施用量[10-11]。目前,基于“3414”的配方施肥試驗在三七[12]、桔梗[13]、燈盞花[14]、枸杞[15]和川貝母[16]等大宗藥材的種植生產中得到廣泛研究和推薦。然而,瑪咖現有的施肥仍主要依靠經驗或參照發育特征類似的農作物或中藥材,盲目性和隨意性較大。僅有的瑪咖施肥研究更多關注于單一肥料的施用或復合肥增施農家肥對瑪咖產量的影響[17-21],缺乏對氮磷鉀三因素綜合肥力考量的研究。為此,本研究采用“3414”試驗方案,將肥料、產量、品質三因素結合,旨在通過對單位面積的精確計算和針對性結果分析,明確氮磷鉀肥配施對瑪咖的產量和品質的影響,提出氮磷鉀的合理施用量,為科學合理指導瑪咖施肥提供參考。
供試品種為烏蒙黑瑪咖(Lepidium meyeniiwumemghei),良種編號:云R-SV-LM-045-2017。
試驗地設在曲靖市會澤縣大海鄉(103°23′E,26°29′N),海拔3 237.70 m,該地土壤類型為亞高山草甸土,前茬作物為馬鈴薯。在試驗進行前,取0~20 cm的土壤測定其化學性質,結果如表1 所示。

表1 大田土壤理化性質Table 1 Physical and chemical properties of field soil
采用“3414”肥效試驗設計,基于N、P、K 3 個因素,設置4 個施肥水平,共14 個處理的復因素試驗方案。每小區6 m×4 m,包括3 條畦(1.8 m×4 m),兩條溝(0.3 m×4 m),溝深25 cm,株行距均25 cm。4 個施肥水平中的0 水平指不施肥,2 水平指當地推薦施肥量(純N=120 kg·hm-2、純P2O5=90 kg·hm-2、 純K2O=120 kg·hm-2),1 水平=2 水平×0.5,3 水平=2 水平×1.5,詳見表2。氮磷鉀肥均采用常用的尿素(純N≥46%)、過磷酸鈣(P2O5≥16%)、硫酸鉀(K2O≥50%)。全部P、K 肥和40%N 肥基施,在移栽后第1 和第2 個月分別追施30%N 肥。采用人工移栽,每穴定植1 苗,定植深度3~5 cm,每小區定植336 株,整平做畦并覆蓋黑色反光防蟲地膜。

表2 氮磷鉀配施處理及施肥量Table 2 Combined application of nitrogen,phosphorus and potassium and fertilization amount /(kg·hm-2)
1.4.1 植株生長指標 在采收前分小區取6 株瑪咖測定其株高、冠幅、葉片數、主根粗、主根長以及地上部和地下部的干重鮮重。
1.4.2 瑪咖活性成分指標
1.4.2.1 瑪咖烯和瑪咖酰胺類化合物測定 稱取0.5 g 瑪咖地下部干樣(粉碎,過40 目篩)至50 mL 離心管中,添加25 mL 石油醚(沸程60~90℃)。然后將樣品置于XUB5 超聲波清洗機(廣州虹科電子)中提取30 min,再以8 000 r·min-1離心10 min,取上清液于250 mL 錐形瓶中。然后對離心管中的殘留樣品重復上述步驟,并將上清液添加到錐形瓶中,過濾上清液,將濾液倒入圓底燒瓶,經旋轉蒸干(50℃以下)后,圓底燒瓶內殘留的固體物即為含有雜質的目的提取物,加甲醇溶解目的提取物,將溶后的目的提取物倒入10 mL 容量瓶中定容,放入4℃冰箱備用。每個樣品重復2 次。
瑪咖酰胺標準曲線制作:取瑪咖酰胺對照品間甲氧基-芐基-亞麻酰胺和間甲氧基-芐基-亞油酰胺各4 mg,瑪咖酰胺對照品芐基-亞麻酰胺、芐基-亞油酰胺和芐基-十六烷酰胺各10 mg,使用乙腈溶解并定容于100 mL 容量瓶中,為5 種瑪咖酰胺混標的標準使用液。分別取標準使用液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mL,加0.9、0.8、0.6、0.4、0.2 和0 mL 乙腈配置成標準系列各濃度用于液相檢測。進樣量為10 μL。
瑪咖烯標準曲線制作:用80%的色譜級乙腈配置1 mL 咖瑪咖烯標準溶液,稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3 μg·mL-1,繪制標準曲線。
高效液相色譜( high performance liquid chromatography,HPLC)檢測:(1)瑪咖酰胺HPLC 檢測條件:色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C8 柱(5 μm,4.6 mm×250 mm);檢測波長210 nm,流速0.6 mL·min-1,進樣量20 μL,等梯度洗脫:90%乙腈;(2)瑪咖烯HPLC 檢測條件:色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C8 柱(5 μm,4.6 mm × 250 mm);檢測波長275 nm,流速0.6 mL·min-1,進樣量20 μL,流動相:90%乙腈。
1.4.2.2 瑪咖芥子油苷類化合物檢測 準確稱取1.00 g 瑪咖地下部干樣(粉碎,過40 目篩)至10 mL離心管中,于75℃條件下水浴保溫5 min 滅酶活,加入8 mL 70%甲醇提取液水浴(75℃)12 min,每隔2 min充分振蕩1 次,8 000 r·min-1離心10 min,轉移上清液至25 mL 容量瓶中。殘渣再提取2 次,離心合并上清液,將提取液定容至25 mL,保存于4℃冰箱備用。取5 mL 樣品溶液于干燥潔凈的25 mL 試劑瓶中,加15 mL 0.02 mol·L-1乙酸鈉緩沖液,加1 mL 每毫升活性單位不低于10 的硫酸酯酶,試劑瓶蓋上蓋子后于37℃恒溫培養箱中保溫16 h 以上至酶解完全。將酶解液轉移至25 mL 容量瓶定容,用0.22 μm 微孔濾膜過濾,用于高效液相色譜分析。
丙烯基芥子油苷標準品配制:精密稱取4 mg 丙烯基芥子油苷標準品,溶解于1 mL 水中。重復上述操作步驟,將過濾后的標品溶液分別取1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL,并用水補充至1 mL,用于HPLC 檢測,并繪制標準曲線。
液相色譜-質譜聯用分析:色譜柱為Eclipse XDBC18(5 μm,4.6 mm×250 mm,美國Agilent),流動相流速1 mL·min-1,柱溫30℃,進樣20 μL,紫外檢測器檢測波長229 nm,流動相為水和乙腈體系,梯度洗脫:0~1 min 為100%水,1~20 min 水梯度變化100%~80%,20~25 min 水梯度變化80%~100%。
1.4.2.3 灰分檢測 將石英坩堝放入高溫爐中,并在550±25℃條件下烘烤30 min,冷卻至約200℃,取出,放入干燥器中30 min,然后稱重。稱取5.000 g 瑪咖樣品,均勻地分布在坩堝中。首先在電熱板上加熱小火,以確保樣品不會完全冒煙,然后將其放入烤箱中,并在550±25℃條件下燃燒4 h。冷卻至200℃,取出并放入干燥器中冷卻30 min,然后稱重。根據公式計算灰分含量:

式中:X 為灰分含量,g·100g-1;m1為坩堝和灰分的質量,g;m2為坩堝的質量,g;m3為坩堝和試樣的質量,g;100 為單位換算系數。
1.4.3 產量 收獲后測單株產量和小區產量,為了排除邊際效應干擾,取樣取中間的畦,每小區取6 株。記錄數據并作肥料效應三元二次方程回歸分析,得出最高產量的施肥量和經濟最佳的施肥量。并根據公式計算各指標:

利用Excel 2010 進行數據整理和作圖,運用SPSS統計軟件進行單因素方差分析。采用測土配方施肥“3414”試驗分析器分析,分析確定瑪咖最高產量和經濟最佳產量以及結合品質要求的氮磷鉀施用量。
2.1.1 氮磷鉀配施對瑪咖地上部農藝性狀的影響 由表3 可知,與不施肥處理(N0P0K0)相比,施肥總體提高了瑪咖株高、冠幅等地上部農藝性狀,且部分施肥處理與不施肥處理差異呈顯著水平。當P、K 肥施用水平為中等(P2K2)時,與不施N 肥處理(N0P2K2)相比,施N分別增加了瑪咖冠幅、地上部鮮重,在N3水平時單株地上部鮮重達到最高,為87.46 g。當N、K 或N、P 施用水平為中等水平(N2K2或N2P2)時,與不施P 肥(N2P0K2)或不施K 肥(N2P2K0)相比,增施P 肥或K 肥能夠增加單株地上部鮮重,并分別以P2或K1水平最高,之后增加P 或K 肥單株重量呈下降的趨勢。

表3 氮磷鉀配施對瑪咖地上部農藝性狀的影響Table 3 Effects of combined application of nitrogen,phosphorus and potassium on agronomic characteristics of L. meyenii shoots
2.1.2 氮磷鉀配施對瑪咖地下部農藝性狀的影響 由表4 可知,與不施肥(N0P0K0)相比,施肥總體提高了瑪咖的主根長、主根粗等地下部農藝性狀。當氮鉀、氮磷或磷鉀肥施用水平為中等水平(N2K2、N2P2和P2K2)時,與各自不施氮肥處理(N0P2K2)、不施磷肥(N2P0K2)或不施鉀肥(N2P2K0)相比,其單株鮮重和干重隨氮、磷、鉀量的增加而增加,至N2P2K2水平達到最高,之后呈下降的趨勢。N2P2K2的單株地下部鮮重達到58.84 g,相比N0P2K2、N2P0K2、N2P2K0分別增長14.14%、31.95%、79.44%。

表4 氮磷鉀配施對瑪咖地下部農藝性狀的影響Table 4 Effects of combined application of nitrogen,phosphorus and potassium on agronomic characteristics of L. meyenii roots
由表5 可知,空白試驗小區瑪咖相對產量為38.23%,缺氮瑪咖的相對產量為68.14%,缺磷試驗小區瑪咖的相對產量為77.94%,缺鉀試驗小區瑪咖的相對產量為70.59%,表現為空白區產量<缺氮區產量<缺鉀區產量<缺磷區產量。表明該試驗地土壤肥力較高,尤其是速效磷和速效鉀。瑪咖對氮的依賴性相對較磷和鉀肥強,缺氮區施肥依存度為31.86%,說明氮肥對瑪咖產量起著重要的作用。氮磷鉀配施時,全肥區施肥依存度為61.77%,說明氮磷鉀三者配合施用能使產量達到最佳。

表5 氮磷鉀配施處理下瑪咖產量和產值Table 5 Effects of combined application of nitrogen,phosphorus and potassium on yield and output value of L. meyenii
瑪咖產量最低的處理水平為N0P0K0,鮮產3 625.44 kg·hm-2;最高為N2P2K2,鮮產9 481.92 kg·hm-2,相比缺氮區(N0P2K2)、缺磷區(N2P0K2)、缺鉀區(N2P2K0)和空白區(N0P0K0)分別增產46.76%、28.30%、41.67%和161.54%。
2.3.1 氮磷鉀配施對瑪咖酰胺含量的影響 由圖1可知,與空白處理A1(N0P0K0)對比,除A13(N1P2K1)外其余各處理瑪咖酰胺類化合物含量均顯著增加。在A10(N2P2K3)施肥水平下瑪咖酰胺類化合物含量最高,為270.63 mg·100g-1,相比A1(N0P0K0) 增長524.58%;其次為A6(N2P2K2),瑪咖酰胺類化合物含量 為181.15 mg·100g-1,相比A1(N0P0K0) 增長318.07%。
在磷鉀肥為中等水平下瑪咖酰胺類化合物含量隨增施氮肥呈上升的趨勢,在A6(N2P2K2)施肥水平達到最高,之后呈下降的趨勢,下降率為92.38%;在氮鉀肥為中等水平下瑪咖酰胺類化合物含量隨增施磷肥呈上升的趨勢,在A6(N2P2K2)施肥水平達到最高,之后呈下降的趨勢,下降率為79.30%;在氮磷肥為中等水平下瑪咖酰胺類化合物含量隨增施鉀肥呈上升的趨勢,在A10(N2P2K3)施肥水平達到最高,為270.63 mg·100g-1。隨著鉀肥施用的增加瑪咖酰胺類化合物含量也隨之增加,表明鉀肥的施用有助于瑪咖酰胺類化合物含量的積累。
2.3.2 氮磷鉀配施對瑪咖烯含量的影響 由圖2 可知,與空白處理A1(N0P0K0)相比,各處理瑪咖烯含量均顯著提高。在P2K2、N2K2或N2P2施肥水平下,瑪咖烯含量隨著氮、磷或鉀肥施用量的增加而增加,至A6(N2P2K2)施肥水平達到最高,之后呈下降的趨勢。其中A6(N2P2K2)施肥水平下瑪咖烯的含量最高,為7.36 mg·100g-1,相比A1(N0P0K0)增長125.08%;A7(N2P3K2) 施肥水平下瑪咖烯的含量僅次于A6(N2P2K2)。
2.3.3 氮磷鉀配施對瑪咖芥子油苷含量的影響 由圖3 可知,與空白A1(N0P0K0)相比,各處理瑪咖芥子油苷類化合物含量均顯著增加。A6(N2P2K2)的總芥子油苷類化合物含量最高,相比A1(N0P0K0)增長118.58%。從整體上可以看出瑪咖芥子油苷類化合物隨著施肥量的增加而增加,在A6(N2P2K2)施肥水平下達到最高,之后呈下降的趨勢。
2.3.4 氮磷鉀配施對瑪咖灰分含量的影響 由圖4可知,與空白A1(N0P0K0)相比,各處理瑪咖灰分含量均顯著增加。A6(N2P2K2)瑪咖的灰分含量達到最高,為4.38 g·100g-1,相比A1(N0P0K0)增長65.99%,但與A5(N2P1K2)、A7(N2P3K2)、A9(N2P2K1)、A10(N2P2K3)、A11(N3P2K2)之間無顯著差異。

圖1 氮磷鉀配施對瑪咖酰胺類化合物含量的影響Fig.1 Effects of combined application of nitrogen,phosphorus and potassium on macaamides content

圖2 氮磷鉀配施對瑪咖烯含量的影響Fig.2 Effects of combined application of nitrogen,phosphorus and potassium on macaene content

圖3 氮磷鉀配施對瑪咖芥子油苷類化合物含量的影響Fig.3 Effects of combined application of nitrogen,phosphorus and potassium on glucosinolates content
在P2K2、N2K2或N2P2施肥水平下,隨著氮、磷或鉀肥施用量的增加瑪咖灰分含量也隨之增加,在A6(N2P2K2)達到最高,之后呈下降趨勢。

圖4 氮磷鉀配施對瑪咖灰分含量的影響Fig.4 Effects of combined application of nitrogen,phosphorus and potassium on ash content
2.4.1 磷鉀肥的施用對氮效率的影響 如圖5 所示,當鉀肥為K2水平時,在低、中氮水平下隨著磷肥施用的增加瑪咖產量隨之增加,分別增產527.85 kg·hm-2(N1)、 1 719.75 kg·hm-2(N2),增產率分別為15.49%、18.14%。當磷肥為P2水平時,在低氮水平下瑪咖產量隨施鉀量的增加而降低,減產93 kg·hm-2,減產率為1.21%;在中氮水平下,瑪咖產量隨施鉀量的增加而增加,增產1 998.60 kg·hm-2,增產率為26.71%。因此,在低氮和低磷水平下瑪咖的產量低于其他施肥水平,在中磷、中鉀和中氮水平下產量最高,在中磷和中鉀水平下,有利于氮肥效果的發揮。

圖5 磷鉀肥施用對氮肥效率的影響Fig.5 Effects of combined application of nitrogen,phosphorus and potassium on nitrogen efficiency
2.4.2 氮鉀肥的施用對磷肥效率的影響 如圖6 所示,當鉀肥施用為K2水平時,瑪咖產量在低磷、中磷水平下隨之施氮量的增加而增加,分別增產為371.85、1 859.25 kg·hm-2,增產率分別為4.79%、19.61%。當氮肥施用為N2水平時,在低磷水平下瑪咖產量隨著施鉀量的增加而降低,減產371.85 kg·hm-2,減產率為4.57%;在中磷水平下,瑪咖產量隨著施鉀量的增加而增加,增產1 998.60 kg·hm-2,增產率為26.71%。因此,在中氮和中鉀水平下,有利于磷肥效果的發揮。

圖6 氮鉀肥施用對磷肥效率的影響Fig.6 Effects of combined application of nitrogen,phosphorus and potassium on phosphate efficiency
2.4.3 氮磷肥的施用對鉀肥效率的影響 如圖7 所示,當磷肥施用為P2水平時,瑪咖產量在低鉀水平時隨施氮量的增加而降低,減產232.50 kg·hm-2,減產率為3.10%;在中鉀水平下,瑪咖產量隨施氮量的增加而增加,增產1 859.25 kg·hm-2,增產率為19.61%。當氮肥施用為N2水平時,在低鉀水平下瑪咖產量隨施磷的增加而降低,減產650.70 kg·hm-2,減產率為8.00%;在中鉀水平下瑪咖產量隨施磷的增加而增加,增產1 719.75 kg·hm-2,增產率為22.16%。在中氮、中磷和低鉀水平下,瑪咖的產量低于其他水平,在中氮、中磷和中鉀水平下,瑪咖的產量最高,在中氮和中磷水平下有利于鉀肥效果的發揮。

圖7 氮磷肥施用對鉀肥效率的影響Fig.7 Effects of combined application of nitrogen,phosphorus and potassium on potassium efficiency
采用測土配方施肥3414 施肥分析軟件,結合肥料價格和瑪咖售價(1.80 元·kg-1N,1.40 元·kg-1P2O5,3.20 元·kg-1K2O,鮮瑪咖10 元·kg-1),建立瑪咖產量和氮、磷、鉀施肥量之間的三元二次回歸分析,結果如表6~7 所示。當最高產量施肥配比N ∶P2O5∶K2O =120.71 ∶92.16 ∶144.22 kg·hm-2,產量達到8 577.35 kg·hm-2;當經濟最佳產量施肥配比N ∶P2O5∶K2O =120.58 ∶91.76 ∶143.35 kg·hm-2,產量達到8 577.29 kg·hm-2。

表6 三元二次肥料效應函數的擬合結果Table 6 Fitting results of ternary quadratic fertilizer effect function

表7 處理回歸方程應用結果Table 7 Processing regression equation application results /(kg·hm-2)
瑪咖產量取決于地下肉質直根的膨大,而植株的生長狀態直接影響肉質直根的膨大和營養成分的積累。本研究發現,與空白試驗對比,氮、磷、鉀配施對瑪咖地上部和地下部的生長有不同程度影響。在相同中等氮鉀水平下,隨著施磷量的增加地上部和地下部鮮重增加,而施磷量在達到一定程度時,對瑪咖產量出現抑制。前人在甘薯[22-24]和油菜[25-27]的研究中也發現,氮磷鉀配施可以提高甘薯和油菜的塊根粗和主根長。
氮磷鉀配施可以有效提高瑪咖酰胺類化合物、瑪咖烯、芥子油苷類化合物、灰分的有效成分含量。在A6(N2P2K2)施肥水平下,瑪咖酰胺類化合物總含量、瑪咖烯含量、芥子油苷總含量、灰分含量最高,分別為181.15 mg·100g-1、7.36 mg·100g-1、2.47 g·100g-1、4.38 g·100g-1,說明氮磷鉀的均衡配施對瑪咖有效成分的積累具有重要作用。在相同中等氮磷水平下,隨著施用鉀肥的增加瑪咖酰胺類化合物含量的也隨之增加,其中A10(N2P2K3)施肥水平下,瑪咖酰胺類化合物的含量最高,為270.63 mg·100g-1。在A7(N2P3K2)施肥水平下,瑪咖烯的含量為7.12 mg·100g-1,且與A6(N2P2K2)相差不大。瑪咖酰胺和瑪咖烯是脂肪酸衍生物。磷是核酸和核蛋白的組成成分,鉀可促進蛋白質的合成,是某些酶或輔酶的活化劑,并且與三磷酸腺苷的活性有關。在植物生長發育過程中,磷鉀主要在能量傳遞體系起介質作用,參與了脂肪酸的合成。高志宏等[28]和趙繼獻等[29]研究發現,在油菜栽培過程中,增施磷鉀肥均可有效提高脂肪酸含量,本研究結果與之一致,適當增施磷肥和鉀肥有利于提高瑪咖酰胺和瑪咖烯的含量。
施肥是保證產量的基礎,不同的肥料配比下產量差別較大。本研究發現,肥料種類對瑪咖相對產量的影響表現為,空白區產量(38.24%) <缺氮區產量(68.14%) <缺鉀區產量(70.59%) <缺磷區產量(77.94%)。瑪咖對氮肥的依賴性相對較磷肥和鉀肥更強,說明磷肥對瑪咖產量發揮著重要的作用。氮磷鉀配施時,全肥區施肥依存度高,說明氮磷鉀三者配合施用能使瑪咖產量達到最佳。
長期以來,對瑪咖的研究較多注重施肥對瑪咖產量或品質的影響,對產量與品質綜合作用的研究較少。本研究將產量與品質相結合,通過三元二次肥料效應函數擬合得出在N2P2K2施肥水平下瑪咖產量和品質最好。邵敏等[30]研究顯示,瑪咖在土壤肥力平衡、田間管理相同的條件下,與施用豬糞、山基土相比,選擇羊糞或復合肥作為瑪咖的種植肥料,可提高單產,增加經濟效益。本試驗所用化肥總量僅為當地使用總量的一半,達到了減施和少量多次施用原則,在提高瑪咖產質量的同時,也提高了瑪咖種植生產過程中的經濟效益。本研究為瑪咖栽培技術提供了更有力的施肥理論與實踐數據支撐。
本研究結果表明,隨著氮、磷、鉀肥不同程度的施用改善了瑪咖地上部和地下部農藝性狀,N2P2K2的氮磷鉀配施效果最好,同時也發現瑪咖對氮的依賴性最高。另外,本研究綜合探討了氮磷鉀配施對瑪咖產、質量的影響,氮磷鉀配施能顯著提高瑪咖的產質量以及促進活性有效成分的積累,并根據三元二次回歸方程對瑪咖產量計算得出最高產量的施肥配比為N ∶P2O5∶K2O=120.71 ∶92.16 ∶144.22 kg·hm-2和經濟最佳產量的施肥配比為120.58 ∶91.76 ∶143.35 kg·hm-2。但本研究土壤基礎肥力具有局限性,建議未來在不同肥力田塊進行大面積試驗,探索不同肥力土壤的最佳施肥配比。