不同凋落物質量對杉木人工林土壤微生物群落結構的影響*

張冰冰，萬曉華，楊軍錢，王 濤，黃志群

（福建師范大學地理科學學院，濕潤亞熱帶山地生態國家重點實驗室培訓基地，福州 350007）

土壤微生物是凋落物分解的主要參與者，在土壤物質轉換、能量流動、生物地球化學循環過程，如有機質分解，養分循環等[1-2]中具有極其重要的作用。土壤微生物對外界條件變化敏感，可反映土壤養分狀況。前期研究發現，有些土壤中，土壤微生物生物量占土壤總有機碳的 5%左右[3]。由于真菌C/N比值高于細菌（15 vs 5），較高的真菌細菌比值被用來指示較高的土壤碳儲存能力[4-5]。革蘭氏陰性細菌偏向于利用新鮮有機碳，而革蘭氏陽性細菌利用大量難以分解的碳[6]。實驗研究發現，革蘭氏陽性與陰性細菌比值會隨著土壤碳有效性的增加而降低，因此該比值可以用來指示土壤碳的有效性或細菌群落受到能量脅迫[7]。

凋落物質量主要指凋落物的化學屬性，其評價指標主要包括凋落物中易分解成分碳、氮、磷等物質以及難分解的有機成分木質素、多酚類物質等的含量、組合情況和比例結構[8]。一般而言，較高質量的凋落物（低C/N、木質素/N比值）分解速率高于較低質量的凋落物（高C/N、木質素/N比值）。實驗研究發現，添加高質量凋落物會增加土壤微生物生物量，激發如革蘭氏陰性細菌等富營養微生物群落的活性[9-10]，而添加低質量的凋落物則會激發如革蘭氏陽性細菌等貧營養微生物群落的生長[11]。有研究表明，不同凋落物質量對土壤理化性質和微生物生物量影響存在差異[12]。Huang等[13]對兩種樹種進行凋落物交換實驗并認為凋落物質量可能是導致土壤微生物生物量差異的原因，但凋落物質量同微生物生物量及群落組成間的關系仍有待進一步驗證和解釋。以往凋落物質量的評價指標主要是其碳、氮及木質素含量，凋落物中的有機碳庫組分卻很少研究。有研究表明凋落物有機碳組分影響著凋落物的分解過程，利用核磁共振技術（NMR），分析凋落物中有機碳結構的差異，有助于人們進一步認識凋落物分解并試圖從中發現新的凋落物質量評價指標。

杉木是中國亞熱帶地區主要的造林樹種，種植面積廣泛。研究發現杉木多年連栽導致地力衰退、土壤肥力下降等問題[14]。近年來，在杉木立地上轉換造林樹種成為改善杉木土壤肥力下降問題的重要舉措。但是如何篩選出適宜的造林樹種，提高土壤質量是當前亟待解決的重要問題。前期研究主要集中在凋落物的分解對土壤有機質和微生物群落組成的影響[15-16]。而關于凋落物質量如何影響土壤有機質及微生物群落組成的影響研究還相對較少。因此，本研究以7年生二代杉木人工林生態系統為研究對象，選擇 8種不同凋落物質量的樹種——毛竹（Phyllostachys heterocycla）、馬尾松（Pinus massoniana），桉樹（Eucalyptus robusta）、杉木（Cunninghamia lanceolate）、樟樹（Cinnamomum camphora）、木荷（Schima superba）、火力楠（Michelia macclurei）、米老棑（Mytilaria laosensis），在杉木人工林內進行原位分解三年后，（1）指示不同凋落物質量指標對土壤微生物影響的差異，量化土壤微生物對不同凋落物質量添加的響應；（2）初步明確不同質量凋落物的添加影響土壤微生物的機制，旨在進一步加強有關凋落物對土壤生態過程和功能影響的了解，為合理經營和恢復杉木人工林土壤質量提供理論依據與實踐指導。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及設計

試驗樣地位于福建省南平市峽陽林場（26°48′N，117°59′ E），地處武夷山脈東南側、閩江上游，海拔高度229～246 m。該區屬中亞熱帶季風氣候，年均溫20.0 ℃，年均降水量1 644 mm，年均蒸發量1 370 mm，年均相對濕度75.2%。土壤主要為石英黑云母片發育的山地紅壤。杉木林土壤本底值見表1。

表1 7年生杉木人工林土壤本底值（平均值±標準差，n=6）Table 1 Soil background value of the 7-year-old Cunninghamia lanceolate plantation（means ± SD, n=6）

2013年9 月，在7年生杉木人工林樣地采用完全隨機區組方法，設置 6個區組，每個區組設置 8種處理（即分別添加毛竹、馬尾松、桉樹、杉木、樟樹、木荷、火力楠、米老排8個樹種的凋落物），共48個小區，每個小區面積為3 m × 3 m。凋落物全碳、全氮含量和C/N用元素分析儀（Elemental EL MAX CNS analyzer，德國）測定。并采用酸性洗滌法ADF測定不同凋落物的纖維素和木質素濃度。凋落物初始性質見表2。碳化學組分采用13C固體核磁共振波譜（13C CPMAS NMR）法測定，實驗條件：25 ℃，氧化硅轉子轉速5 kHz，接觸時間2 ms，接受時間13 ms，重復延遲時間2.5 s。不同凋落物中碳化學組成見表3。

表2 供試凋落物性質（平均值±標準差，n=6）Table 2 Properties of the litters used in the experiment（means ± SD.n=6）

表3 不同凋落物中碳化學組成相對比例Table 3 Relative proportions of the chemical components of the carbon in litter relative to type of litter/%

根據2012年3月至2013年3月在同塊樣地收集的杉木人工林凋落物的數據，得到杉木人工林凋落物平均每月生產力為0.5 kg·m–2，按此量來添加凋落物量。2013年9月至2015年3月，每月定期在相應處理小區添加凋落物，均勻覆蓋在小區土壤表面。

1.2 土壤樣品采集與測定

2016年1 月，在凋落物添加處理3年后，避開人為干擾和樹干徑流，在各試驗小區內移除地被物后用PVC管沿S形鉆取6個土樣（0～10 cm），并混合成一個樣品，用冰盒快速轉移至實驗室，去除砂石、根系碎屑等并過2 mm篩。一部分土樣凍干后采用磷脂脂肪酸（Phospholipid Fatty Acid，PLFA）生物標記法進行分析。磷脂脂肪酸在White等[17]方法的基礎上，參考Bossio和Scow等[18]優化的步驟進行提取，最后將得到的磷脂脂肪酸甲酯化，在氣相色譜儀（Agilent 7890A）上采用 MIDI 系統軟件進行分析，測定磷脂脂肪酸各組分的含量。

稱取10 g新鮮土樣加入40 mL的2 mol·L–1KCl溶液浸提，振蕩 0.5 h 后并 4 000 r·min–1離心 10 min，過0.45 μm玻璃纖維濾膜，濾液采用連續流動分析儀（Skalar San++，荷蘭）測定土壤銨態氮（-N）、硝態氮（-N）。將部分土壤在室溫下自然風干，并取部分土樣過0.149 mm篩，用以測定土壤全碳、全氮含量和pH等。土壤pH用pH計測定（土水比1︰2.5）；土壤全碳、全氮含量和 C/N采用德國Elementar 公司生產的碳氮元素分析儀（Vario Max）測定。

1.3 數據處理

數據錄入和統計處理基于Excel 2013進行，相關分析及方差分析基于SPSS 22.0軟件進行，使用Origin9.0作圖。采用LSD最小顯著差數法對凋落物性質和土壤理化特性進行差異顯著性的比較，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）來檢驗不同凋落物添加處理對土壤微生物生物量和群落結構的影響，顯著水平設為α = 0.05。采用多元統計分析軟件Canoco 5.0進行冗余分析，來檢驗土壤及凋落物等環境變量與土壤微生物群落結構之間的相關性。

2 結 果

2.1 不同質量凋落物添加下土壤理化性質的比較

不同凋落物添加下對土壤理化性質產生的影響不同（表4）。8種凋落物添加下土壤碳氮比為12.80～13.72，不同凋落物添加處理下的土壤碳氮比未產生顯著差異（P>0.05）。添加高質量凋落物如馬尾松、毛竹、桉樹等土壤 pH與低質量凋落物添加下土壤 pH相比差異不顯著。與杉木凋落物添加相比，除樟樹凋落物添加外，其他凋落物添加均使得土壤 pH表現出下降趨勢。添加高質量凋落物土壤全碳、全氮差異較小，馬尾松凋落物添加下土壤全碳、全氮顯著低于杉木凋落物添加。除米老棑凋落物添加外，高質量凋落物添加下土壤銨態氮的含量顯著降低。土壤硝態氮含量毛竹與火力楠凋落物添加下的差異不顯著，但明顯高于其他凋落物添加。毛竹添加下土壤礦質氮含量顯著高于其他凋落物添加。

表4 不同凋落物添加處理下土壤化學性質的變化Table 4 Chemical properties of the soil relative to treatment

2.2 不同質量凋落物添加下土壤微生物群落組成及群落結構

8種凋落物添加下對土壤微生物脂肪酸生物量的影響不同（圖1）。通過土壤微生物PLFA圖譜發現，不同質量凋落物添加下土壤的微生物種類和數量差異明顯。桉樹凋落物添加下，土壤磷脂脂肪酸總量顯著高于其他凋落物添加，較杉木凋落物添加多27%。樟樹凋落物添加下土壤磷脂脂肪酸總量最低，較杉木凋落物添加少29%。桉樹凋落物添加下，革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌都顯著高于其他凋落物添加，分別較杉木凋落物添加多35%和19%。樟樹凋落物添加下革蘭氏陰性細菌量最低，較杉木凋落物添加少10%。桉樹凋落物添加下細菌和真菌量最多，分別較杉木凋落物添加多25%和44%。樟樹凋落物添加下放線菌量最少，較杉木凋落物添加少32%，其他凋落物添加下放線菌沒有顯著差異。總體而言，添加桉樹凋落物增加土壤磷脂脂肪酸總量、細菌和真菌生物量以及革蘭氏陽性和陰性細菌生物量，而添加樟樹凋落物顯著降低土壤磷脂脂肪酸總量、細菌、真菌、放線菌、革蘭氏陽性和陰性細菌生物量。

不同凋落物添加下真菌與細菌、革蘭氏陽性細菌與革蘭氏陰性細菌的比例存在顯著性差異（P<0.05）。桉樹凋落物添加顯著高于其他凋落物添加下真菌/細菌比值，除桉樹、木荷的真菌/細菌外，其他凋落物添加下真菌/細菌無明顯差異。樟樹凋落物添加下的革蘭氏陽性細菌/革蘭氏陰性細菌（G+/G–）顯著高于其他凋落物添加下革蘭氏陽性細菌/革蘭氏陰性細菌（G+/G–），除樟樹、杉木的革蘭氏陽性細菌/革蘭氏陰性細菌（G+/G–），其他凋落物添加下無明顯差異（圖2）。

2.3 土壤微生物群落組成與土壤化學性質及凋落物質量的相關分析

對微生物群落組成與凋落物質量的相關性分析（表5），結果表明，凋落物碳含量與土壤中革蘭氏陽性細菌、真菌呈極顯著正相關（P<0.01），與脂肪酸總量、革蘭氏陰性細菌和菌根真菌呈顯著正相關（P<0.05）。

基于相關性分析探討有機碳化學組分結構與土壤微生物的關系（表5），其中烷基碳、烷基碳/氧烷基碳與脂肪酸總量、革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、細菌、真菌及真菌/細菌比均呈極顯著正相關（P<0.01），與革蘭氏陽性陰性細菌比均呈極顯著負相關（P<0.01）。氧烷基碳與乙縮醛與脂肪酸總量、革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、細菌、真菌及真菌/細菌比均呈極顯著負相關（P<0.01）。甲氧基碳、氧烷基碳和芳碳與革蘭氏陽性陰性細菌比呈顯著正相關（P<0.05）。

表5 不同凋落物添加下土壤微生物PLFAs與凋落物質量及有機碳組分的相關性Table 5 Correlation between PLFAs of soil microorganisms，litter quality and organic carbon components relative to treatment

為進一步探討土壤微生物群落組成與土壤化學性質及凋落物質量之間的關系，進行了冗余分析。從圖3可知，其中第1主軸共解釋了50.6%的變異；第2主軸解釋了46.7%的變異。所有的環境因子中，對土壤微生物群落結構產生顯著影響的分別為Alkyl C（烷基碳）（P= 0.036）和土壤全氮（P=0.04）。物種變量和環境變量的關系表明（圖3），Alkyl C（烷基碳）與16︰1ω7c、18︰1ω7c、18︰2ω6c、18︰1ω9顯著正相關。

3 討 論

本研究發現，將不同質量凋落物放在杉木人工林內分解3年后，土壤微生物群落組成發生了顯著變化。凋落物質量，尤其是烷基碳，能夠很好地指示土壤微生物群落組成的變化。以往研究通常將凋落物的C/N，木質素/N比值作為凋落物質量的指標。但也有研究發現，這兩個指標并不能很好地指示土壤微生物學過程，如微生物群落組成、氮循環過程等。本研究中凋落物初始碳含量與總磷脂脂肪酸、真菌和細菌含量顯著相關，而其他凋落物特性（凋落物碳氮比（Litter C/N）、木質素比氮（Lignin/N）等）和微生物指標相關性不顯著，Lignin/N和 C/N與土壤生物學的關系不明顯。不同化學組分相對含量的數據（例如，鏈烷碳、甲氧基碳、多糖碳、芳碳、羧基碳等），較木質素和全碳，可以更精細地區分凋落物質量差異，能夠克服木質素和全碳作為評價樹木凋落物質量指標的缺點。本研究發現，有機碳庫組分如烷基碳、甲氧基碳、氧烷基碳、乙縮醛、酚碳以及烷基碳/氧烷基碳和微生物生物量指標之間均具有顯著的相關性。烷基碳與真菌呈顯著正相關，革蘭氏陽性細菌與陰性細菌比值與烷基碳呈顯著負相關，這與前人的研究結果一致[19]，表明凋落物有機碳化學組分能夠對土壤微生物群落組成產生影響。

添加其他樹種凋落物3年后，土壤磷脂脂肪酸總量有顯著變化。真菌細菌比值除桉樹外，均低于杉木，革蘭氏陽性與陰性細菌比值則高于杉木。原因可能是土壤中可利用的養分減少，有機質含量降低及難分解有機物質增加。有研究表明，隨著凋落物的持續分解，微生物能夠吸收利用的有機物（糖類、蛋白質等）逐漸減少[20]，一般土壤有機質和有效養分減少后，土壤細菌豐度降低，真細菌比值會增加。桉樹真細菌比高于杉木，可能是因為桉樹獨特的化感作用影響細菌的生長繁殖。其他樹種比如木荷等真細菌比值低于杉木，可能是由于這些闊葉樹種凋落物中含有大量的易變性有機碳，通過分解進入土壤后，能夠為微生物，尤其是細菌提供大量碳源，因此較杉木真菌比值低。隨著凋落物分解時間的延長，可利用養分減少，難分解有機物質（纖維素、木質素等）比例逐漸增加[8]，較革蘭氏陰性菌利用難分解有機物質能力更強的革蘭氏陽性菌的比例也會隨著凋落物分解而升高。

此外，在13C-NMR波譜解析的官能團中，烷基碳表征難分解碳如木質素、單寧等；氧烷基碳表征易被利用的碳水化合物，即易分解碳。研究表明難分解碳含量越高，有機物的分解速率越慢[20]。本研究發現其他樹種的凋落物烷基碳均低于杉木和桉樹，利于凋落物分解速率的加快，同時，其他凋落物中易分解的氧烷基碳相對含量均高于杉木和桉樹。革蘭氏陽性/陰性細菌比值高，革蘭氏陽性細菌偏向于利用土壤有機質，而革蘭氏陰性細菌偏向于利用新鮮的植物殘體作為碳源，革蘭氏陽性與陰性細菌比值高表明土壤中細菌群落碳的有效性低，說明除桉樹和杉木外，其他凋落物分解快，隨著時間的增加，碳的有效性逐漸降低。可能的原因是凋落物分解后，難分解有機質比例增加。由于養分的限制，不僅真菌會發生變化，細菌群落內部也會發生變化。

在杉木人工林中，凋落物質量是調控土壤養分循環和微生物生物量變化的重要因子。研究結果顯示，不同質量凋落物添加后土壤磷脂脂肪酸含量之間表現出顯著差異。本結果表明，添加桉樹凋落物分解3年后，土壤總微生物、細菌、真菌生物量均顯著高于杉木人工林，而樟樹凋落物分解3年后，土壤總微生物、細菌、放線菌生物量均顯著低于杉木及其他凋落物添加，這與早些的研究[21-22]結果相同，與Thoms等[23]用磷脂脂肪酸分析法測得的土壤微生物量結果相一致，即不同樹種下凋落物輸入的不同，使得土壤中磷脂脂肪酸含量具有顯著差異。陳法霖等[24]的研究指出，不同C/N、木質素/N的凋落物導致土壤微生物群落結構發生變化，濕地松凋落物添加降低了土壤細菌和放線菌的磷脂脂肪酸含量，凋落物質量扮演著十分重要的角色。凋落物質量影響分解速率，凋落物進入土壤后，其活性有機質為微生物的生長提供了碳源，能夠激發微生物生長。本研究中桉樹凋落物（尤其是凋落葉）的易分解性，參與凋落物分解的土壤微生物數量較多，桉樹凋落物添加下的土壤微生物量均有顯著增加。因此，在杉木人工林中，凋落物輸入是土壤微生物的主要碳源，不同質量凋落物的輸入和分解，使杉木人工林土壤環境發生變化，微生物組成出現不同程度的差異。本研究探索了有機碳化學組分作為新的評價凋落物的指標對土壤微生物的影響，但僅討論了多種單一凋落物添加，在一定程度上具有局限性。

4 結 論

在我國亞熱帶地區，杉木人工林添加不同凋落物分解后，林地土壤微生物群落組成存在顯著差異，說明不同質量凋落物的添加對土壤微生物群落結構具有顯著影響。桉樹凋落物添加下土壤總磷脂脂肪酸以及細菌真菌等生物量均顯著高于其他凋落物添加，其對提高土壤微生物量的作用優于其他凋落物。在此基礎上繼續開展凋落物多樣性對杉木人工林生態系統的研究利于更好地揭示物種多樣性對杉木人工林土壤環境的影響，為杉木人工林可持續經營與管理提供科學依據。