糖化血紅蛋白檢測技術的研究進展

凌蘭芳

摘要：近年來，糖化血紅蛋白的檢測已成為糖尿病診斷及監測的有效指標，現就目前糖化血紅蛋白檢測方法的研究進展進行綜述。

關鍵詞：糖化血紅蛋白，檢測技術，綜述

【中圖分類號】R331.1+41 ? ? ? ? ? ? 【文獻標識碼】A ? ? ? ? ? ? 【文章編號】2107-2306（2021）05-112-01

1 ?概述

近年來，我國糖尿病患者的人數逐年攀升，據中國官方統計數據，2020版的指南更新的流調數據顯示，糖尿病患病率已達11.2%。糖尿病的治療是一個漫長的過程，因而對糖尿病的健康管理顯得尤為重要，手段主要以飲食管理和降糖藥物控制為主，聯合空腹血糖與糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）定期監測血糖水平，有效控糖。HbA1c是在長時間、高濃度血糖存在的條件下，血紅蛋白與葡萄糖進行非酶促反應結合形成的一種產物，其生成過程緩慢且不可逆，并且貫穿存在于紅細胞的整個生命周期中（120天），濃度相對穩定，反映的是患者過去2～3個月的平均血液中葡萄糖水平，可以聯合空腹血糖等其他指標診斷及監測糖尿病。現就目前檢測糖化血紅蛋白的檢測方法研究進展進行綜述。

2 ?HbA1c的檢測方法

HbA1c為屬于血紅蛋白p鏈的一個或兩個n端纈草上的d-葡萄糖，是一種生物標記物，用于診斷和識別患糖尿病（DM）的高危患者。根據糖尿病的診斷標準， HbA1c 水平>6.5%（>48mmol/mol）可導致糖尿病;而把HbA1c水平介于5.7-6.4%（39-46mmol/mol）歸為糖尿病前期。近年來，糖化血紅蛋白的檢測技術也越來越標準化，目前可分為以下幾大類。

2.1 免疫反應法 ?利用抗原抗體特異性反應檢測糖化血紅蛋白，以血紅蛋白β鏈糖化N末端的4～8個氨基酸殘基作為識別位點，生產單克隆抗體，按照反應結合物質的不同，可形成不同的檢測方法。

2.1.1膠乳凝集抑制法 ? 檢測試劑中以數個HbA1c抗原決定簇形成的聚集物作為凝集素，抗-HbA1c抗體抗原與之結合形成不溶性的抗原抗體復合物，加入全血樣本后，血液中的HbA1c將與聚集物產生競爭關系，爭奪乳膠顆粒上的抗-HbA1c抗體，抑制凝集物生成，根據測定的吸光度值可計算出HbA1c在總血紅蛋白（Hb）中的百分含量。該方法成本低、快速、基本能保證檢測準確性，可在全自動生化儀上完成，適用于大批量樣本檢測，但易受高濃度的葡萄糖、三酰甘油及膽紅素等物質干擾[2]。

2.1.2膠乳凝集免疫比濁法  HbA1c與抗-HbA1c抗體復合物是可溶性的，再加入多聚半抗原緩沖液抗原與剩余的抗-HbA1c抗體結合成不可溶性物質，雙通道分別測定溶液中Hb和HbA1c的含量，即可求得HbA1c在總Hb中的百分含量，該方法精密度高，線性良好，雖然影響因素較多，但鑒于成本低，可進行自動化的臨床優勢，還是具有一定的替代價值。

2.1.3離子捕獲法 ?即化學發光法，將熒光標記物結合到HbA1c抗原抗體復合物上，再聯結帶負電荷的多聚陰離子形成復合物，該復合物會吸附于試劑中的帶正電荷的纖維表面，經反復清洗后可測定其熒光強度，從而得到HbA1c的濃度。該方法與上述兩種方法具有相似的檢測優越性，且回收率高，交叉污染率低[3]。

2.1.4熒光免疫法與放射免疫法 ?熒光法為離子捕獲法的衍生方法，原理相同，但可計算HbA1c的濃度。熒光法和放射法的檢測優略勢幾乎相同，可批量、重復檢測，且準確度、精密度、特異性都較為良好，干擾因素也極少，但前者儀器及試劑成本高昂，后者制備試劑困難，故兩種方法在臨床上難以作為常規檢測方法[4]。

2.2電荷間差異檢測

2.2.1離子交換層析法 ?原理為血紅蛋白糖化后所帶電荷改變，在不同pH的磷酸鹽緩沖液中，可以將樹脂上不同吸附力的GHb組分（包括HbA及HbA1的各組分）分批依次洗脫出來，繪制相應Hb的層析譜，即可求得HbA1c在GHb的百分率。常見的離子交換層析法主要有樹脂微柱法、低效液相色譜法（LPLC）及高效液相色譜法（HPLC），其中HPLC 是目前為國際公認的檢驗HbA1c的金標準，但此法相關儀器、試劑及耗材昂貴，在基層醫院難以推廣普及;LPLC 測定原理與HPLC一致，但LPLC難以分辨變異血紅蛋白，往往將其歸為HbA1c，使假陽性率偏高，樹脂微柱法適合檢測大量標本，但干擾因素極多，且重復性較差。

2.2.2電泳法 ?常用的有瓊脂糖凝膠電泳法、等電聚焦電泳法和毛細管電泳法等，基于GHb各組分泳動速度不同從而將其分離再測量含量，該方法的干擾因素較少，且分辨率高，可提示變異Hb的存在，毛細管電泳法對血紅蛋白變異體的抗干擾能力優于HPLC，但自動化程度低，且儀器昂貴[5，6]。

2.3 ?基于結構差異進行檢測

2.3.1親和層析法 ?原理為硼酸根離子可逆性地與GHb中葡萄糖分子的順位二醇基聯結，加入血液樣本后，非糖化血紅蛋白會直接流出層析柱進入洗脫液，再加入高濃度的含順位二醇基的山梨醇替換GHb，GHb也進入洗脫液，此時通過測定洗脫液吸光度可計算出GHb所占百分比。該方法僅能用于檢測總GHb，不能分離組分，檢測結果與平均血糖值、HPLC 等法所測HbA1c百分率呈高度相關性，所以使用該方法時可以允許經驗算法計算HbA1c。

2. 4 ?基于化學反應性質差異檢測

利用特異性內切酶切斷GHb的糖化甘氨酰谷氨酰胺，減少了血漿中其他蛋白對檢測結果的干擾，測出Hb濃度;在果糖氨基酸氧化酶和過氧化物酶的催化下，生成的過氧化氫與顯色劑發生反應，產生顏色改變，在通過相關的測量后即可求得HbA1c的百分率。該反應系統快速、單一，適用于全自動生化分析儀測試，精密度高。

2.5 ?免疫傳感器

Lee[7]利用金納米顆粒開發了兩種傳感器盒檢測HbA1c水平，一個是基于光學原理的聚合物基薄膜傳感器盒，另外一個是石英晶體微天平傳感器盒。王瀟[8]等人構建了16通道無標記型特異檢測HbA1c的電化學免疫傳感器，經HbA1c抗體修飾的優化型16-SPCE電化學免疫傳感器具有較好的電化學響應性能、選擇性、穩定性，能穩定、有效地檢測復雜體系中的HbA1c，提高準確度，對于糖尿病患者來說，易于小型化、即時檢測和操作簡單的優勢極大地方便了他們的生活，減少頻繁奔于醫院的疲憊[8]。

3 ?結語

目前市面上檢測HbA1c的試劑很多，應用的方法原理也各不相同，精密度和準確度以及抗干擾能力也千差萬別。有的適合于輔助診斷，則要求有較高的精密度和準確度比如高效液相色譜法（HPLC），是目前為國際公認的檢測HbA1c的金標準，但其缺點是易受異常血紅蛋白的影響，且價格較高;有的適合于床邊檢測（POCT），目前主要方法有兩種，第一種是顯色親和層析法，在親和層析法的基礎上將硼酸根陰離子改成水溶性藍色苯硼酸染料，第二種是熒光免疫法[9]，其是糖代謝控制情況和糖尿病性昏迷等并發癥風險評判的最好的方法[10];現有一種HbA1c檢測試劑剛上市，它不須要投入任何設備，檢測卡上有個云實驗室的識別碼，在卡上加血樣反應后用安裝有相應APP的手機同時掃描檢測區和識別碼，信號傳輸到云實驗室檢測，幾秒后檢測結果便傳到手機上，這很適合于基層社區醫院推廣使用。

參考文獻：

[1]Rizza Stefano et al.Alterations in Rev-ERBα/BMAL1 ratio and glycated hemoglobin in rotating shift workers：the EuRhythDia study.[J].Acta diabetologica，2021.

[2]王少婷，劉倩，于洋，王艷，曹永彤.糖化血紅蛋白的檢測方法及標準化研究進展[J].中日友好醫院學報，2019，33（01）：38-40+44.

[3]楊日東.糖化血紅蛋白臨床檢測方法的研究進展[J].醫學理論與實踐，2017，30（11）：1594-1596.

[4]趙瑩.糖化血紅蛋白實驗室檢測技術及方法學進展[J].中國醫療器械信息，2020，26（10）：25-26

[5]李洋.電泳法在糖化血紅蛋白檢查中的效果[J].中國城鄉企業衛生，2020，35（10）：85-86.

[6]肖翔，鐘陽青，陳艷清，賈建，張偉龍，潘理想.毛細管電泳法檢測糖化血紅蛋白的方法學性能評價[J].中國醫學創新，2018，15（11）：126-130.

[7]Lee Soo Suk. Novel Detection Technology for Glycated Hemoglobin using Gold Nanoparticles[J].Journal of Sensor Science and Technology，2016，25（6） ： 435-439.

[8]王瀟，宓現強.16通道無標記型糖化血紅蛋白檢測免疫傳感器的構建[J].檢驗醫學，2019，34（09）：835-840.

[9]李新華，趙珂，魏芳，丁文宇，張勇，黃亞麗.顯色型親和層析法檢測糖化血紅蛋白的建立及性能評估[J].中國糖尿病雜志，2016，24（10）：892-896.

[10]Girlescu Nona et al.Thanatochemical Study of Glycated Hemoglobin in Diabetic Status Assessment[J]. Medicina， 2021， 57（4）：342-342.