魚皮低聚肽對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用

陳頔 殷繼永 黃建

摘 要：目的：探究魚皮低聚肽（FOPs）對酒精損傷小鼠肝功能及糖脂代謝的影響。方法：將60只KM小鼠作為研究對象分為空白組（蒸餾水）、模型組（蒸餾水）、陽性組（水飛薊素，200 mg/kg BW）、FOPs組（250、500、1 000 mg/kg BW）。實驗第33天灌胃制ALD模型。對小鼠各相關聯指標（肝功能、血糖、血脂和氧化）的含量和活性進行檢測，并量化分析肝組織的脂滴情況進行。結果：FOPs氨基酸的成分組成甘氨酸（Gly）含量最高，其中90.61%均為低于1 000 U的小肽;FOPs各劑量組小鼠血清的肝功能指標AST、ALT活力和血脂TG、TC含量顯著降低（P<0.05），250、500 mg/kg BW FOPs的TC含量略低于陽性組;FOPs 各劑量組與模型組比較，肝臟合成蛋白指標TP、ALB含量隨濃度的增加而升高，FOPs（250、1 000 mg/kg BW）組血糖GLU含量則明顯增高（P<0.05）;250、1 000 mg/kg BW劑量組肝組織過氧化指標MDA含量顯著降低（P<0.05），FOPs各劑量組肝組織抗氧化指標GSH活性明顯增高，甚至優于空白組，與模型組相比差異顯著（P<0.05）。小鼠肝組織油紅O染色表明，FOPs緩解小鼠急性酒精肝細胞損傷的脂肪病變程度顯著（P<0.05）。結論：FOPs在急性乙醇小鼠的肝功能損傷和糖脂代謝方面方面具有良好的保護功能。

關鍵詞：魚皮低聚肽（FOPs）;乙醇;急性肝損傷;保肝功能

3～9個氨基酸單體經過組合構成了蛋白質的前體，而這所謂的蛋白質前體也被稱作低聚肽，食物蛋白質在蛋白酶的酶解后，即可生成這種3～9個氨基酸殘基的物質[1-2]。低聚肽不僅具有比原蛋白、游離的氨基酸更容易被人體吸收的特征，還具有很多生理活性。魚皮低聚肽（FOPs）是一種運用生物酶解技術經過魚皮中提取并制備出來的小分子的活性肽生物物質，平均分子量低于1 000D[3]。該小分子肽的氨基酸組成不僅均衡、全面，還含有多種如纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸及賴氨酸等必需氨基酸[4]。研究表明，FOPs在給予機體不斷地提供氮源的同時，還具備了免疫調節、抗氧化、抗腫瘤、改善皮膚水分等生理活性[5-7]。近年來，來源于可食用物質的外源性活性肽由于其在多方面生理活性中的重要性，成為了各界的研究熱點[8]。

作為分解代謝環節重要的器官——肝臟，過度甚至是有害的飲酒習慣均極易造成肝臟損傷，該類情況引起的一系列疾病稱作酒精性肝病（ALD）[9-10]。由于人們對酒精的隨意使用和相對依賴，使之僅次于病毒性肝炎成為第二大肝臟性疾病[11]。經過文獻搜索發現，FOPs對酒精性急性肝損傷及其機制的深入研究鮮有報道。在急性肝損傷模型中，酒精一次性大量攝入性肝損傷模型最接近于人類豪飲所致肝損傷的ALD早期損傷特點[12]，所以本研究擬通過FOPs，對小鼠進行乙醇急性肝損傷研究，通過這種急性模型的刺激和效果評估，以期評價并確定FOPs的肝功能相關指標，從而為FOPs的保肝功能的有效干預提供有益且可靠的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級昆明系（KM）雌性小鼠，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，6～8周齡，體重18～22 g，共計60只。動物合格證：SCXK（京）2016-0011。

1.2 材料與試劑

FOPs，中食海氏生物技術有限公司;水飛薊素，Sigma公司;乙醇，95%，分析純，天津致遠化學試劑公司;MDA、GSH檢測試劑盒，南京建成科技有限公司;AST、ALT、TP、ALB、GLU、TG、TC檢測試劑盒，北京和光純藥工業株式會社提供。

1.3 主要儀器與設備

高速離心機，德國 Eppendorf、Omega全自動多功能酶標儀，德國 BMG LABTECH、7080全自動生化儀，日本日立、冰凍切片機CM1850，德國Lecia、Ti-S熒光倒置顯微鏡，日本Nikon。

1.4 方法與指標

1.4.1 FOPs氨基酸組成及相對分子量分布 相對分子量分布檢測采用高效液相色譜凝膠法[13];GB 5009.124—2016食品中氨基酸的測定方法檢測氨基酸的組成[14]。

1.4.2 動物分組及造模方法 按體重將60只適應飼養5 d后小鼠隨機分為空白、模型、陽性和FOPs低、中、高劑量組（250、500、1 000 mg/kg BW），每組10只。陽性組為每日200 mg/kg BW水飛薊素，空白和模型組給予等量純凈蒸餾水，按照0.1 mL/10 g標準連續灌胃32 d，并根據每周體重變化量調整灌胃體積。除空白組繼續給予等量純凈蒸餾水外，其他5組均于第33天，50%乙醇，0.13 mL/10 g灌胃復制造模，并于禁食、自由進水16 h后，小鼠摘眼球取血，4 000 r/min 離心 15 min 分離血清，吸取上清液保存，完整剝離處死小鼠肝臟并去除脂肪組織和膽囊稱取重量，計算其肝重指數。小鼠肝臟左葉干凈剖取后切片，鏡檢下觀察脂滴情況;另取剩余部分制成10%的肝組織勻漿。

1.4.3 指標（1）肝重指數的計算 待完整干凈的剝離動物肝臟后，對表面的血污進行沖洗，吸干表面多余水分后，稱重，計算肝重指數。（2）小鼠血清和肝臟相關聯指標檢測 對血清中肝功能指標ALT、AST、TP、ALB、血糖GLU和血脂TG、TC指標進行測定，對10%肝組織氧化指標MDA、GSH進行檢測。（3）小鼠肝臟油紅O染色切片觀察 乙醇致毒小鼠的肝臟內脂滴情況及其評分標準參照《保健食品檢驗與評價技術規范-2003》進行量化。

肝重指數（%）=肝臟重量（g）/小鼠終體質量（g）*100[15]

1.5 數據分析

SPSS 22.0統計軟件對實驗數據進行處理和分析，結果用±s表示;采用單因素方差分析法對組間數據進行差異比較，P<0.05、P<0.01表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 FOPs理化特性

由表1、表2、圖1可知，FOPs占比前4位的氨基酸分別為甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala），比例分別為21.30%、13.50%、9.35%、8.50%。其組成主要以混合小分子肽結構為主，140～500 U占主要比例，含量達到54.88%。

2.2 FOPs對小鼠肝重指數的影響

由表3可知，WKM小鼠模型組的肝重指數顯著高于空白組（P<0.01），該結果說明酒精的急劇攝入使肝臟受損從而腫大，酒精急性肝損傷模型造模成功。FOPs 中、高劑量組、陽性組的肝重指數均顯著低于模型組（P<0.05），且FOPs高劑量組肝臟指數低于陽性組。

2.3 FOPs在小鼠血清肝功能、血脂血糖指標的影響

由表4可見，與空白組相比，模型組血清的肝功能指標AST、ALT活性和血糖GLU、血脂TG、TC含量一致性顯著升高，而反映肝臟蛋白質合成功能指標TP、ALB含量則明顯降低（P<0.05）。相較于模型組，FOPs各組的AST、ALT活性均顯著降低（P<0.01）;1 000 mg/kg BW 劑量組的TP含量和500、1 000 mg/kg BW劑量組ALB含量呈顯著性增加（P<0.05），且TP、ALB含量的絕對值隨著濃度的增加呈遞增態，但均沒有完全好于陽性組，而FOPs各劑量組AST、ALT活性則低于陽性組;250、1 000 mg/kg BW FOPs 劑量組血糖GLU含量明顯高于模型組（P<0.05），3個劑量組FOPs的TG、TC含量顯著低于模型組，250、500 mg/kg BW FOPs的TC含量略低于陽性組。

2.4 FOPs在小鼠肝組織MDA和GSH的影響

由表5可見，模型組與空白組比較，ALD造模后，氧化指標MDA含量顯著升高2.46（μmol/g肝），且明顯降低了GSH活性0.56（μmol/g肝）（P<0.05）。250、1 000 mg/kg BW劑量組FOPs的MDA含量明顯低于模型組（P<0.05），其中高劑量組MDA含量甚至接近于陽性組;FOPs的GSH活性較空白組更高，尤以500 mg/kg BW最為突出。

2.5 FOPs對小鼠肝組織脂滴變化的影響

由表6、圖2可看出，乙醇急性肝損傷模型小鼠的肝組織油紅染色，觀察肝臟脂肪改變程度。剖取的模型組肝組織外觀色澤暗黃，組織紋理粗糙，并伴有白色顆粒，空白組則色澤鮮紅，表面光滑。經油紅O染色肝組織內的脂肪滴鏡檢呈紅或鮮紅色，被紅染的脂肪滴多數的輪廓清晰可見。模型組的肝臟脂滴被紅染的面積顯著多于空白對照組，FOPs 3個劑量組及陽性組的肝臟脂質顏色較淺，病變程度積分差異較模型對照組比較均具有統計學意義（P<0.05），且FOPs高劑量組病變程度積分與水飛薊素陽性對照組相同。

3 討論

ALT和AST在肝細胞壞死、炎癥活動中是極為重要的指標，血清ALT和AST活力對肝損傷程度較為敏感[16-17]。肝組織細胞受到破壞變性后，使得肝細胞通透性增高，主要的酶ALT從細胞內逸出;線粒體中的 AST 當受到肝細胞嚴重病變壞死時便釋放出來[18]。肝臟能夠主要合成血清白蛋白，當ALB濃度受阻降低后，血清TP含量隨之降低[19]。王曉紅等[20]研究發現，酒精能夠降低血漿中脂聯素的含量，最終導致血糖濃度的升高。本實驗結果顯示，模型與空白組相比較，血清的肝功能指標AST、ALT活性和GLU、TG含量顯著升高，而TP、ALB含量則明顯降低（P<0.05）。經受試物FOPs影響后，血清中AST、ALT活性水平逐漸降低，TP、ALB含量隨受試物濃度的升高而增加，說明其在保肝功能上的作用是毋庸置疑的，但同時也發現，受試物血糖的含量不但沒有增加，反而在低、高濃度上顯著性增加，這與我們前期的預期效果正好相反，在之后的研究中，有必要再進行重復性實驗對該指標進行觀察。ALD導致的一系列與酒精性肝損傷相關的表現，包括脂滴沉積、血清和肝臟總TG和TC的升高和抗氧化酶活性的降低以及過量脂質氧化產物的產生等[21-22]。作為酒精性肝損傷的一個特征性指標—TG，在整個的肝臟代謝過程中，NADH/NAD+比率會嚴重失調，從而會造成TG的轉運遭到抑制，使脂肪酸的氧化受阻，TG含量升高[23]。本研究結果表明，在血清中，與模型組比較，FOPs TG、TC含量顯著下降（P<0.05），脂代謝趨于正常。

自由基作用于脂質過氧化的產物MDA，其含量反映了體內脂質過氧化的程度[24]，而GSH在與谷胱甘肽—S—轉移酶和GSH—Px結合后，在ROS的防御機制中承擔了重要的角色[25]。該實驗結果可見，FOPs明顯降低肝組織脂質過氧化指標MDA含量的同時，提高了GSH活性（P<0.05），從而對自由基的生成起到抑制作用。

本研究結果發現，急性肝損傷模型的建立，使得模型組的肝臟指數顯著高于空白對照組（P<0.05），這表明造模后，肝臟受損并腫大，陽性組和FOPs各劑量組肝臟指數較模型組均顯著降低（P<0.05），這與劉睿等[8]、丁榮榮[26]等的研究結果一致。本研究發現，模型組與空白組比較，肝組織細胞內大小不同的圓粒脂滴被油紅O清晰地染成紅色，且面積較大，脂肪變性程度具有顯著性差異（P<0.05），FOPs各劑量組則顯著減少了紅色脂滴面積，與模型對照組比較，變性程度顯著緩解（P<0.05）。由此提示，FOPs能夠降低TG等一系列脂質的有害堆積，減緩肝組織在脂質代謝中的紊亂程度，從而起到對損傷的肝組織的保護作用。

本研究使用的FOPs經分析，分子量大部分在1 000 U以下，且氨基酸種類全面豐富，這也是該受試物能夠有效的被人體吸收，最大效果的發揮其功能作用的原因。

參考文獻

[1]劉洋，王梅.腸外與腸內營養藥臨床應用的現狀分析[J].中國醫藥導刊，2006，8（6）：459-462.

[2]張永秀，王世平，周若蘭.Flavourzyme蛋白酶解牛骨制備低聚肽的處理條件研究[J].食品工業科技，2006，27（7）：141-143.

[3]王軍波，謝英，裴新榮，等.海洋魚皮膠原肽的分子組成及其降血脂和抗氧化作用研究[J].中華預防醫學雜志，2008，42（4）：226-230.

[4]劉桂琴，朱翠鳳，李艷飛，等.海洋膠原肽對2型糖尿病大鼠過氧化應激標志物表達的影響lJ].中國組織工程研究與臨床康復，2008，12（23）：4469-4472.

[5]Kim SK，Wijesekara I.Development and biological activities of marine-derived bioactive peptides：a review[J].J Funct Foods，2010，2（1）：1-9.

[6]Meisel H.Food-derived bioactive proteins and peptides as potential components of nutraceuticals[J].CurrPharm Des，2007，13（8）：771-772.

[7]潘興昌，葛文津，柳園，等.口服海洋魚皮膠原肽對人體皮膚水份和黃褐斑影響的研究[J].華西醫學，2012，27（7）：218-222.

[8]劉睿，珠娜，劉欣然，等.桃低聚肽對急性酒精性肝損傷大鼠保護作用[J].中國公共衛生，2020，2（36）：192-195.

[9]丁榮榮，姜啟興，王斌，等.殼寡糖對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用研究[J/OL].食品科學，2019，1-7.

[10]Xia T，Zhang J，Yao J，et al.Shanxi aged vinegar protects against alcohol-induced liver injury via activating Nrf2-mediated antioxidant and inhibiting TLR4-induced inflammatory response[J].Nutrients，2018，10（7）：E805.

[11]秦亞東，汪榮斌，周宇.不同產地白及多糖含量測定[J].安徽科技學院學報，2014，28（3）：41-44.

[12]齊慧慧，宋佳，陳岳祥.小鼠急性酒精性肝損傷模型的建立[J].世界華人消化雜志，2012，20（9）：759-763.

[13]劉艷，谷瑞增，魯軍，等.烏雞低聚肽的成分分析及抗氧化活性研究[J].食品科技，2015，40（3）：236-241.

[14]食品中氨基酸的測定：GB 5009.124—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[15]劉明，陳紹紅，鐘贛生，等.葛花枳椇子配伍對酒精性肝損傷大鼠肝臟功能及病理形態的影響[J].南京中醫藥大學學報，2015，31（2）：147-151.

[16]肖柳英，潘竟鏘，饒衛農，等.荔枝核顆粒對小鼠肝損傷保護作用的實驗研究[J].中華中醫藥雜志，2005，20（1）：42-43.

[17]翟文婷，朱獻標，李艷麗，等.牡丹籽油對小鼠急性肝損傷的保護作用[J].中國油脂，2013，38（11）：43-45.

[18]彭文鋒，鐘政永.ADA 與 ALT、AST、GGT 聯合檢測在肝臟疾病診斷中的意義[J].當代醫學，2011，17（9）：4-6.

[19]Mathurin P，Hadengue A，Bataller R.EASL clinical practical guidelines：management of alcoholic liver disease[J].Journal of Hepatology，2012，57（2）：399-420.

[20]王曉紅，曹琦，汪思應，等.酒精性肝病中脂聯素作用及其與HO-1關系[J].中國公共衛生，2011，27（4）：455-457.

[21]Zhao L.，Wang Y，Liu J，et al.Protective effects of genistein and puerarin against chronic alcohol-induced liver injury in mice via antioxidant，anti-inflflammatory，and anti-apoptotic mechanisms.[J].Agric.Food Chem.，2016（64），7291-7297.

[22]Xiao J.，Zhang R，Huang F，et al.Lychee（Litchi chinensis Sonn.）pulp phenolic extract confers a protective activity against alcoholic liver disease in mice by alleviating mitochondrial dysfunction[J].Agric.Food Chem，2017（65）：5000-5009.

[23]張蘭蘭，何承輝，古麗斯坦·阿吾提，等.桑椹提取物對小鼠急性肝損傷保護作用[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22（15）：149-152.

[24]閆冰，李黎，陳星，等.二至丸的保肝活性部位群對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（1）：216-219.

[25]Rasool M，WKhan S R，Malik A，et al.Comparative studies of salivary and blood sialic acid，lipid peroxidation and antioxidative status in oral squamous cell carcinoma（OSCC）[J].Pakistan Journal of Medical Sciences，2014，30（3）：466-471.

[26]丁榮榮，姜啟興，王 斌，等.殼寡糖對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用[J].食品科學，2019，40（13）：161-165.

Protective Effect of Fish Skin Oligopeptides on Acute Hepatic Injury Induced in Mice

CHEN Di，YIN Ji-yong，HUANG Jian

（National Institute for Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention/Key Laboratory of Trace Element Nutrition of National Health Commission of People’s Republic of China，Beijing 100050，China）

Abstract：【Objective】 To investigate the effects of Fish skin oligopeptides（FOPs）on liver function and glucose and lipid metabolism in mice with alcohol injury.【Method】 Totally 60 KM mice were divided into blank（distilled water），model（distilled water），positive group（silymarin，200 mg/kg BW）and FOPs groups（250，500，1 000 mg/kg BW）.On the 33rd day，the ALD model was made by gavage.The content and activity of the relevant indicators（liver function，blood sugar，blood lipid and oxidation）of the mice were detected，and the lipid droplets in the liver tissue were quantitatively analyzed.【Result】 The contents of glycine（Gly）in FOPS amino acids were the highest，90.61% of which were small peptides less than 1 000 U.The activities of AST and ALT and the contents of TG and TC in serum of mice in FOPs were significantly decreased（P<0.05），The content of TC in 250 and 500 mg/kg BW FOPs was slightly lower than that of positive group.Compared with model group，the contents of TP and Alb in FOPs increased with the increase of concentration，while the content of GLU in 250 and 1 000 mg/kg BW groups was significantly increased（P<0.05）.The content of MDA in liver tissue in 250 and 1 000 mg/kg BW groups was significantly decreased（P<0.05），while the activity of GSH in FOPS groups was significantly higher，even better than that of blank group，and the difference was significant compared with model group（P<0.05）.Oil red O staining of mice liver tissue showed that FOPs significantly alleviated the degree of fatty lesions in mice with acute alcoholic liver cell injury（P<0.05）.【Conclusion】 FOPS has a good protective effect on liver function injury and glycolipid metabolism in acute ethanol mice.

Keywords：FOPs;ethanol;acute liver injury;liver protection function

基金項目：國家重點研發計劃（項目編號：2016YFD0400602）。

作者簡介：陳 頔（1985— ），女，碩士，助理研究員，研究方向：營養干預。

通信作者：黃 建（1969— ），男，研究員，研究方向：營養干預。