介孔二氧化硅包載香葉木素對IL-1β誘導的大鼠體外骨關節炎的作用研究

何明為 韋慶軍

摘要：目的：對比MSNs@DM和單純DM對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞炎癥損傷的作用。方法：提取5天齡的SD乳鼠的軟骨細胞進行培養，分為空白對照組（Control），骨關節炎組（OA），香葉木素組（DM），載藥組（MSNs@DM），分別處理24小時后，行HE染色觀察各組大鼠的細胞形態及數量，并提取各組大鼠的總RNA，行qRT-PCR檢測相關炎癥的表達。結果：與OA組相比，DM組和MSNs@DM組細胞形態較接近于Control組;在細胞數量上，MSNs@DM組和DM組均比OA組多，而且MSNs@DM組相較于DM組多。MSNs@DM組相關炎癥指標基因的表達均低于OA組（P<0.05）和DM組（P<0.05）。結論：MSNs@DM相比于單純DM更能有效維持IL-1β誘導的大鼠體軟骨細胞炎癥損傷的形態，并抑制相關炎癥基因的表達，對骨關節炎有積極的治療作用。

關鍵詞：介孔二氧化硅;香葉木素;軟骨細胞;骨關節炎

【中圖分類號】R-03 【文獻標識碼】A 【文章編號】2107-2306（2020）01-026-02

骨關節炎（osteoarthritis， OA）是一種以關節軟骨退行性改變為特征的疾病，會引起關節疼痛、僵硬、壓痛和活動范圍縮小等，是常見的肌肉骨骼疾病之一[1]。目前治療OA的方式有止痛藥物（如撲熱息痛和非甾體抗炎藥）、手術等[2]。然而這些治療僅能緩解癥狀，很難延緩OA的發展。有研究表明，香葉木素（diosmetin， DM）具有較強的抗炎、抗氧化作用[3]，是治療OA的潛力藥物;但是由于DM水溶性差、不利于吸收的特點，藥物的實際利用率較低。介孔結構的二氧化硅納米顆粒（mesoporous silica nanoparticles， MSNs），由于具有極高的比表面積和孔徑體積，已被作為藥物緩釋載體應用于生物醫學研究中[4]。因此，本研究以MSNs為載體負載DM（MSNs@DM），研究其對IL-1β誘導的大鼠體外骨關節炎的影響，為今后進一步研究新型的OA治療方式提供實驗依據。

1.材料與統計學方法

1.1 材料 動物為5天齡SD乳鼠，由廣西醫科大學動物實驗中心提供。主要試劑：MSNs、DM（化學結構式如圖1A）購于麥克林公司（http：//www.macklin.cn/）;高糖培養基、胰蛋白酶、雙抗、MTT和HE染色試劑盒購買于北京索來寶公司（http：//www.solarbio.com/）;PCR引物合成于武漢金開瑞生物公司;胎牛血清購買于Gibco公司。主要儀器：全波長熒光酶標儀（Thermo，美國）;正置熒光顯微鏡（Olympus，日本），PCR儀（light-cycler，美國）。

1.2 統計學方法 以SPSS 22.0統計軟件處理數據，并以（均數±標準差）呈示。組間比較采用One-way ANOVA，兩兩比較采用LSD檢驗，P<0.05被認為差異具有統計學意義。

2.方法與結果

2.1 DM對IL-1β體外誘導的大鼠軟骨細胞炎癥損傷的作用

提取SD乳鼠原代軟骨細胞進行培養至第3代。將軟骨細胞接種于96孔板，每孔5×103個細胞，放置于37℃培養箱中培養。待細胞完全貼壁后，先加入含有不同濃度DM的高糖培養基（含10%胎牛血清和1%雙抗）作用2小時，隨后更換含有相同濃度DM的高糖培養基（含IL-1β 10ng/mL，10%胎牛血清和1%雙抗）。作用24小時后，分別向每孔培養基中加入20μL的MTT，繼續置于培養箱中4小時后棄掉多余培養基，加入200μL DMSO并避光孵育15-20分鐘。最后用全波長熒光酶標儀在570nm處測定光密度值（OD value）。結果如圖1B所示，DM在20μM 時，對經IL-1β體外誘導的大鼠軟骨細胞保護效果最佳。

2.2 MSNs@DM對IL-1β體外誘導的大鼠軟骨細胞炎癥損傷的作用

為對比MSNs@DM和DM對IL-1β （10ng/mL）體外誘導的大鼠軟骨細胞的作用，我們以MSNs作為藥物載體，按照等效濃度為20μM的量將DM載入MSNs中得到含20μM 的MSNs@DM。之后，我們將第3代軟骨細胞分別接種在6孔板（50×103個/孔）及24孔板（10×103個/孔）爬片中，分別為Control組，OA組，DM組，MSNs@DM組。按如前所述分組分別加入含不同藥物成分的培養基作用2小時后，更換含有相應藥物成分的且含有IL-1β （10ng/mL）的高糖培養基。在干預24小時后，我們分別取出各組細胞爬片，用PBS緩沖液沖洗3遍后以多聚甲醛在室溫下固定20分鐘，之后進行HE染色。染色結果如圖2，蘇木素將細胞核染成藍色，伊紅將細胞質染成紅色。同OA組對比，我們發現DM組和MSNs@DM組細胞形態和數量更接近于Control組;并且OA組的細胞形態狹長且數量減少，說明IL-1β能誘導軟骨細胞的炎癥損傷。此外，我們還從6孔板中提取了各組細胞的總RNA并進行qRT-PCR檢測了炎癥因子的表達（MMP3、MMP13和IL6）。本研究所用引物：MMP3（上游：GGCTGTGTGCTCATCCTACC;下游：TGGAAAGGTACTGA AGCCACC）;MMP13（上游：GGACAAAGACTATCCCCGCC;下游：GGCATGACTCTCACAATGCG）; IL6（上游： ACAAGTCCGGAGA GGAGACT;下游： ACAGTGCATCATCGCTGTTC）;GAPDH（上游：TCCAGTATGACTCTACCCACG;下游：CACGACATACTCA GCACCAG）。PCR結果如圖3所示：與Control組對比，炎癥指標MMP3、MMP13和IL6均明顯升高（p<0.05）。而對比DM組，MSNs@DM組的炎癥指標表達更低（p<0.05）。以上結果提示MSNs@DM組比DM組更能有效抑制IL-1β誘導的軟骨細胞損傷。

3.討論

OA是全球老年人最常見的關節疾病，也是慢性肌肉骨骼疼痛和行動不便的主要原因[5]。目前對于OA尚無最佳的治療方式，OA進展到晚期需要進行關節置換術才能減輕疼痛和改善身體功能。因此，尋找能延緩OA進展的方式將能為臨床治療提供指導性意義。

研究表明，IL-1β可引起軟骨細胞中的基質金屬蛋白酶類MMPs、IL6、TNF-α等炎癥因子合成、分泌及活性增加[6]，導致軟骨細胞基質降解進而導致關節軟骨的退變，最終發展為骨關節炎。DM是天然黃酮類化合物的一種，廣泛存在于甘菊藍、紫草和薄荷等天然植物中，具有抗炎、抗氧化、抗休克等功效[7]。有研究報道，DM可通過抑制破骨細胞的分化，降低軟骨下骨的丟失，進而對小鼠的骨關節炎有一定的治療作用[8]。然而，由于裸露在細胞外環境中的DM水溶性差，易被細胞外環境所代謝，以致細胞的藥物吸收率降低。因此，本研究使用具有緩釋作用的藥物載體MSNs包載DM，可以實現藥物載細胞外環境中的緩慢釋放，是之持續有效地對細胞起到保護作用。本實驗研究發現，IL-1β （10ng/mL）誘導后的軟骨細胞其炎癥指標如MMP3、MMP13和IL6等表達量明顯增加。而在DM作用后，其炎癥指標有所降低，我們的研究結果除了進一步驗證了DM對軟骨細胞驗證損傷的保護作用之外，我們還發現了經MSNs包載的DM，對軟骨細胞的驗證損傷效果比單純藥物DM的治療更佳，提示了MSNs可作為藥物載體包載藥物并運用在體外骨關節炎的治療中。

綜上所述，MSNs@DM比單純DM對IL-1β誘導的體外軟骨細胞的損傷的保護作用更佳，能為OA的治療提供新的思路。

參考文獻：

[1]Xiao， L.， D. Williams， and M.M. Hurley， Inhibition of FGFR Signaling Partially Rescues Osteoarthritis in Mice Overexpressing High Molecular Weight FGF2 Isoforms. Endocrinology， 2020. 161（1）.

[2]王晶璐， 黃芩素對IL-1β誘導的骨關節炎軟骨細胞NF-κB信號通路的影響. 東北農業大學.

[3]Patel， K.， et al.， A Review on Pharmacological and Analytical Aspects of Diosmetin：A Concise Report. Chinese Journal of Integrative Medicine， 2013. 2（10）： p. 46-52.

[4]Wahba， S.M.R.， et al.， Sugarcane bagasse lignin， and silica gel and magneto-silica as drug vehicles for development of innocuous methotrexate drug against rheumatoid arthritis disease in albino rats. Materials Science & Engineering C. 48： p. 599-610.

[5]Chen， Y.， et al.， Association between bisphosphonate use and risk of undergoing knee replacement in patients with osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases， 2018. 78（2）： p. annrheumdis-2018-212998.

[6]He， Y.， et al.， Costunolide inhibits matrix metalloproteinases expression and osteoarthritis via the NFkappaB and Wnt/betacatenin signaling pathways. Mol Med Rep， 2019. 20（1）： p. 312-322.

[7]Cameron， M. and S. Chrubasik， Oral herbal therapies for treating osteoarthritis. 2013.

[8]丁洪志， et al.， 香葉木素通過抑制破骨細胞分化治療早期骨關節炎的可行性研究. 實用藥物與臨床， 2019. 22（10）： p. 1023-1029.

基金項目：廣西研究生教育創新計劃項目（YCSW2019109）

（1.廣西生物醫藥協同創新中心 廣西南寧 530021;2 廣西醫科大學第一附屬醫院 創傷骨科手外科 廣西南寧 530021）