miRNA-200s介導(dǎo)SEC23A調(diào)節(jié)的分泌蛋白組對(duì)慢性阻塞性肺疾病（COPD）EMT的影響及機(jī)制研究

朱敏 陸建萍 高靜 來(lái)依寧 吳葉菊 卡米拉 黃麗歡

摘要： 目的 探討miRNA-200s介導(dǎo)的SEC23A調(diào)節(jié)的分泌蛋白組對(duì)EMT的影響及機(jī)制。方法 熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)在氣道上皮細(xì)胞中，miRNA-200s是否通過(guò)結(jié)合3′ UTR而調(diào)節(jié)SEC23A的表達(dá)。WS刺激Rat AECs和16HBE，使miRNA-200s過(guò)表達(dá)或者低表達(dá)，運(yùn)用熒光共聚焦， RT-PCR，Western blot 和Sircol assay檢測(cè)SEC23A和Col I的表達(dá)變化。另外，使SEC23A過(guò)表達(dá)或者siRNA，觀察是否出現(xiàn)EMT的改變。運(yùn)用熒光共聚焦， RT-PCR，Western blot 和Sircol assay檢測(cè)Col I的表達(dá)變化。結(jié)論 在COPD的SAR發(fā)生發(fā)展中，miRNA-200c可以靶向調(diào)節(jié)SEC23A介導(dǎo)的Collagen I分泌，這種分子調(diào)節(jié)進(jìn)而對(duì)EMT產(chǎn)生影響，該過(guò)程將成為SAR發(fā)生分子機(jī)制的一條新型信號(hào)途徑，可能成為COPD治療的一個(gè)有效干預(yù)靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：miRNA-200s SEC23A 慢性阻塞性肺疾病（COPD） EMT

【中圖分類號(hào)】R322.3 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2107-2306（2020）01-092-01

在COPD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，小氣道重塑（Small Airway Remolding， SAR）形成是COPD氣流阻塞的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，是COPD病變持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素【1】。本文旨在探討miRNA-200s介導(dǎo)的SEC23A調(diào)節(jié)的分泌蛋白組對(duì)EMT的影響及機(jī)制，研究如下：

（1）研究?jī)?nèi)容

探討miRNA-200s介導(dǎo)的SEC23A調(diào)節(jié)的分泌蛋白組對(duì)EMT的影響及機(jī)制。

（2）研究目標(biāo)

①明確參與SAR的miRNA-200s亞型，探討該亞型以及SEC23A表達(dá)改變，及其與SAR的相關(guān)性。

②探討miRNA-200s通過(guò)對(duì)SEC23A介導(dǎo)的分泌蛋白組的靶向調(diào)節(jié)對(duì)EMT的影響和分子機(jī)制，評(píng)估該新型信號(hào)途徑是否可能成為COPD治療的一個(gè)有效干預(yù)靶點(diǎn)。

（3）擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題

①明確miRNA-200s在SAR發(fā)生發(fā)展中的作用，鑒定新的參與調(diào)節(jié)SAR發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵靶基因和通路。

②闡明miRNA-200s通過(guò)對(duì)SEC23A介導(dǎo)的分泌蛋白組的靶向調(diào)節(jié)對(duì)EMT的影響和分子機(jī)制。

（4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果一：

①首先采用Targetscan軟件分析結(jié)果顯示，miRNA-200s含有和Sec23a基因的3’UTR結(jié)合的保守位點(diǎn)。

②構(gòu)建SEC23A 3’UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（野生型和突變型），與miRNA-200c 模擬物共轉(zhuǎn)染，熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶的活性，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果證實(shí)，共轉(zhuǎn)染野生型SEC23A 3’UTR熒光素酶質(zhì)粒和pre-miRNA-200c，與其他各組相比，熒光素酶活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果二：

①SEC23A對(duì)Collagen I分泌的調(diào)節(jié)：在Sec23a基因敲除的胚胎間充質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SEC23A-GFP使SEC23A過(guò)表達(dá)，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)SEC23A的細(xì)胞可以促進(jìn)Collagen I分泌到細(xì)胞外，呈現(xiàn)典型的纖維絲狀結(jié)構(gòu)。而沒(méi)有過(guò)表達(dá)SEC23A細(xì)胞則使Collagen I不能分泌出細(xì)胞。在培養(yǎng)的胚胎成纖維細(xì)胞中，正常成纖維細(xì)胞可以將Collagen I分泌到細(xì)胞外呈纖維狀，而完全敲除Sec23a基因則導(dǎo)致分泌到細(xì)胞外的Collagen I減少，細(xì)胞間隙完全沒(méi)有Collagen I沉積。Sec23a敲除導(dǎo)致Collagen I分泌減少負(fù)反饋調(diào)節(jié)引起Collagen I合成進(jìn)一步減少。

②SEC23A表達(dá)改變對(duì)EMT的影響：WSC刺激16HBE，使SEC23A過(guò)表達(dá)或者siRNA，蛋白印跡結(jié)果顯示SEC23AsiRNA促進(jìn)細(xì)胞上皮型標(biāo)記蛋白E-cat表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)型標(biāo)記蛋白Vimentin表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明SEC23AsiRNA抑制EMT現(xiàn)象的發(fā)生，上皮表型轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞樣的間質(zhì)表型減少，從而促進(jìn)Collagen I的分泌減少，而SEC23A過(guò)表達(dá)促進(jìn)EMT發(fā)生，Collagen I的分泌增加。

討論

Col I的蛋白合成后轉(zhuǎn)入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER），經(jīng)過(guò)正確折疊的蛋白經(jīng)過(guò)COPII（Coat protein complex II ，COPII）轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體進(jìn)行進(jìn)一步修飾，最終分泌到細(xì)胞外。COPII由SAR1，SEC23–SEC24復(fù)合體，以及SEC13–SEC31復(fù)合體五種成分組成，負(fù)責(zé)將大部分分泌蛋白從ER轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體。SEC23在COPII中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，分為SEC23A和SEC23B兩個(gè)亞型。其中SEC23A可以加速細(xì)胞外基質(zhì)蛋白從ER到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)，擔(dān)負(fù)著這些蛋白的分泌和合成的功能【2】。我們結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)和研究進(jìn)展，推測(cè)SEC23A可能通過(guò)介導(dǎo)Col I 的合成和分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)EMT，從而在COPD的SAR中發(fā)揮重要作用。miRNAs調(diào)節(jié)很多分子和細(xì)胞過(guò)程。異常miRNAs表達(dá)可以導(dǎo)致很多病理性疾病的發(fā)生和發(fā)展。特別是miRNA-200s可以特異性抑制SEC23A的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)SEC23A介導(dǎo)的分泌蛋白組（Secretome），在乳腺腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用【3】。基于TGF-beta刺激肺泡上皮形成的肺纖維化模型中miRNA-200s下調(diào)，Sec23a表達(dá)明顯上調(diào)，我們推測(cè)在COPD的SAR發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，miRNA-200s可能調(diào)控SEC23A的表達(dá)。結(jié)論，在COPD的SAR發(fā)生發(fā)展中，miRNA-200c可以靶向調(diào)節(jié)SEC23A介導(dǎo)的Collagen I分泌，這種分子調(diào)節(jié)進(jìn)而對(duì)EMT產(chǎn)生影響，該過(guò)程將成為SAR發(fā)生分子機(jī)制的一條新型信號(hào)途徑，可能成為COPD治療的一個(gè)有效干預(yù)靶點(diǎn)。

該項(xiàng)目獲得新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2016D01A020）支持

參考文獻(xiàn)：

[1]Hogg JC， Chu F， Utokaparch S， Woods R， Elliott WM， et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. New England Journal of Medicine2004; 350： 2645–2653.

[2]Ishikura-Kinoshita S， Saeki H， Tsuji-Naito K. BBF2H7-mediated Sec23A pathway is required for endoplasmic reticulum-to-Golgi trafficking in dermal fibroblasts to promote collagen synthesis J Invest Dermatol 2012， 132：2010–2018.

[3]Korpal M1， Ell BJ， Buffa FM， Ibrahim T， Blanco MA， Celià-Terrassa T， Mercatali L， Khan Z， Goodarzi H， Hua Y， Wei Y， Hu G， Garcia BA， Ragoussis J， Amadori D， Harris AL， Kang Y. Direct targeting of Sec23a by miR-200s influences cancer cell secretome and promotes metastatic colonization. Nat Med. 2011 Aug 7;17（9）：1101-8.

作者簡(jiǎn)介：

朱敏（1978.8）女;漢族，湖北武漢，主任醫(yī)師，博士;研究方向：呼吸與消化病理及精準(zhǔn)醫(yī)療。

（克拉瑪依市中心醫(yī)院 834000）