miR-22-3p在妊娠期糖尿病患者胎盤外泌體中的表達及其對血管內(nèi)皮細胞功能的影響*

鄭 芳，肖新益

（湖北省黃石愛康醫(yī)院婦科，黃石 435000）

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）作為臨床上常見的妊娠并發(fā)癥，嚴重影響母嬰健康，其不僅增加孕產(chǎn)婦及胎兒的致死致殘率，也使GDM 患者及其子代遠期罹患糖尿病、肥胖等代謝及心腦血管疾病的風(fēng)險顯著增加[1-3]。胎盤組織血管病變是GDM 主要病理損傷之一。同時，有數(shù)據(jù)證實GDM患者與胎兒血管內(nèi)皮細胞已出現(xiàn)初期病理性改變，這可能與GDM 母體與子代不良預(yù)后具有相關(guān)性[4]。外泌體（exosomes）是由雙層磷脂分子所包裹的囊泡樣小體（直徑約為30～150 nm），其能作為細胞與組織間重要的信息載體，將其內(nèi)的生物信息物質(zhì)（如蛋白、DNA、mRNA、miRNA/lncRNA 等）傳遞給靶細胞，從而參與影響后者的功能[5-6]。microRNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核細胞內(nèi)，主要通過與靶基因的3’非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮負性調(diào)控基因表達的短鏈非編碼RNA[7]。大量研究表明，在GDM患者胎盤組織中miRNA表達譜較正常妊娠者出現(xiàn)顯著改變，其中miR-22-3p 呈異常高表達現(xiàn)象[7-9]。而最新一項研究[6]顯示，miR-22-3p 在GDM 患者胎盤外泌體中的表達同樣顯著高于正常妊娠女性，這提示miR-22-3p 在GDM 中的作用可能不僅限于胎盤組織，還能夠通過外泌體的形式影響其他組織器官。既往關(guān)于miR-22-3p在研究表明，miR-22-3p能夠通過影響血管內(nèi)皮細胞功能而參與影響心腦血管疾病的進展[10-11]。基于以上研究背景，本實驗通過體內(nèi)外實驗檢測miR-22-3p 在GDM 患者胎盤外泌體中的表達及其相關(guān)作用機制，以期進一步闡明GDM發(fā)生、發(fā)展的分子機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2018年10月至2019年7月在湖北省黃石愛康醫(yī)院婦科產(chǎn)科住院分娩的GDM孕產(chǎn)婦10例(GDM組)，另取同時期年齡及孕周相匹配的正常妊娠孕產(chǎn)婦10 例作為對照組（Normal組）。GDM 的診斷參考謝興等主編的第9 版《婦產(chǎn)科學(xué)》的診療標準[12]。納入標準：（1）年齡在23～35歲的育齡期女性；（2）自然受孕，單胎妊娠，且處于37～41孕周內(nèi)；（3）GDM組孕產(chǎn)婦符合GDM診斷標準。排除標準：（1）年齡＜22歲或＞35歲者，孕周＜37 周或＞41 周者；（2）非自然妊娠，或多胎妊娠者；（3）妊娠前診斷為糖尿病者；（4）妊娠合并心腦血管、肺、肝、腎等疾病，妊娠合并甲狀腺等內(nèi)分泌疾病者。本研究經(jīng)我院倫理委員會審批，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 細胞系及主要試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細胞系（HUVEC）購自美國ATCC 細胞庫；RPMI 1640、0.25 %胰蛋白酶（美國Hyclone 公司）；TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）；胎牛血清（FBS）、青鏈霉素混合液（均為100 U/mL）（杭州四季青生物公司）；內(nèi)皮細胞生長因子（ECGS）（美國Sciencecell 公司）；PCR試劑盒（日本TaKaRa）；CD63多克隆抗體（美國Bioworld公司）；TSG101、PLAP、Netrin-1及GAPDH單克隆抗體（美國SantaCruz 公司）；CCK-8 試劑盒（美國Sigma 公司）；含miR-22-3p mimic、miR-22-3p inhibitor 及陰性對照序列（miR-NC）的質(zhì)粒（上海吉瑪生物公司）；Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司）;免疫組化EnVison 二步法試劑盒、二氮基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）；熒光酶檢測試劑盒（美國Promega 公司）；辣根過氧化酶標記（HRP）的二抗（武漢博士德生物公司）；PCR 引物有上海生工合成。

1.3 胎盤組織樣本采集 胎盤娩出后立即從胎盤中央處取約2 cm×1 cm 大小的胎盤全層組織3～5塊，避開出血點及鈣化梗死灶，無菌生理鹽水沖洗干凈后迅速置于冰上運回實驗室以備后續(xù)實驗使用。

1.4 外泌體的分離及鑒定 參考文獻[13]的方法進行胎盤外泌體的分離，具體方法如下：取孕產(chǎn)婦空腹肘靜脈血3 mL，經(jīng)過濾、蔗糖不連續(xù)密度梯度離心純化，PEG6000進行沉淀后所得沉淀物即為胎盤外泌體,并將Normal組外泌體記為N-exo,GDM組記為GDM-exo。取約10 μg胎盤外泌體進行適當稀釋后，3.5%的多聚甲醛固定后滴加到銅網(wǎng)上，2%的鈾酸鹽染色，室溫晾干后應(yīng)用透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀察外泌體形態(tài)；參考NanoSight NS300 納米粒徑分析儀（nanoparticle tracking analysis,NTA）使用說說方法測量外泌體的粒徑大小及分布；采用Western blotting 實驗檢測外泌體特征性蛋白CD63、TSG101 及胎盤外泌體特征性蛋白抗體PLAP的表達。

1.5 細胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染 常規(guī)復(fù)蘇HUVEC 后使用含10%FBS、1%青鏈霉素與10 ng/mL ECGS 的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。待HUVEC 貼壁生長融合至80%時，0.25 %的胰酶進行消化傳代。取生長匯合至80%的HUVEC，調(diào)整細胞密度至2×105個/孔接種至6 孔板中培養(yǎng)過夜；轉(zhuǎn)染前將更換培養(yǎng)基為Opti-MEM，參考轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000 說明書，將100 nmol/L的含miR-22-3p mimic、miR-22-3p inhibitor、miR-NC的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入HUVEC內(nèi)，6 h后將培養(yǎng)基更換為含10%FBS 的DMEN/HG 常規(guī)培養(yǎng)基中并置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后更換含有2 μg/mL嘌呤霉素與10%FBS的DMEM/HG培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d,將細胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)板中，待1～2周細胞出現(xiàn)克隆時，挑取單克隆至6孔板中進行擴大培養(yǎng)，建立上述轉(zhuǎn)染細胞的穩(wěn)定細胞系以備后續(xù)實驗使用。

1.6 細胞分組 將方法“1.5 項”中轉(zhuǎn)染后的HUVEC安實驗?zāi)康姆譃?組，分別為陰性對照組（negative control，NC 組），使用含常規(guī)葡萄糖濃度（5.6 mmol/L）的RPMI1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)的HUVEC；高糖組（highglucose，HG 組），使用葡萄糖濃度為30 mmol/L 的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)的HUVEC;高糖+miR-22-3pmimic組（HG+miR-22-3p mimic組），高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic 的HUVEC；高糖+miR-22-3p inhibitor組（HG+miR-22-3p inhibitor），高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)轉(zhuǎn)染miR-22-3p inhibitor后的細胞；高糖+miR-NC 組,即高糖培養(yǎng)液進行培養(yǎng)的經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-NC 后細胞。上述各組細胞培養(yǎng)24 h 后，收集細胞，以備后續(xù)實驗使用。

1.7 CCK-8 檢測細胞的增值活力 取轉(zhuǎn)染后的HUVEC，常規(guī)消化后調(diào)整細胞密度至2×103個/孔接種于96 孔板中，上述條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，更換為無血清培養(yǎng)基饑餓細胞6 h，并按“1.4 項”分組方法進行不同處理后置于培養(yǎng)箱進行常規(guī)培養(yǎng)，分別于0 h、12 h、36 h、48 h 時向每孔加入10 μL CCK-8 試劑，置于酶標儀490 nm 波長處檢測每孔吸光度值（D490），每組每個時間點每組設(shè)置5個復(fù)孔，繪制各組細胞的生長曲線。

1.8 內(nèi)皮細胞遷移能力檢測 Martrigel基質(zhì)膠4 ℃溶解后，按1∶8 比例使用RPMI-1640 培養(yǎng)基進行稀釋，并取40 μL 稀釋后的基質(zhì)膠均勻平鋪于12 孔板底層。取轉(zhuǎn)染后的HUVEC，將調(diào)整細胞密度至2×104個/孔接種至12孔板中，按方法“1.6項”進行不同分組處理。每組設(shè)定3 個復(fù)孔，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察小管形成情況，計算形成的管樣節(jié)點數(shù)。

1.9 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）采用TRIzol法提取待測細胞中總RNA，分光光度計檢測濃度與純度后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.按照RT-PCR試劑說明書確定的反應(yīng)體系及條件進行實時定量，RT-PCR 反應(yīng)條件為：95°C（30 s）預(yù)變性后，變性95°C（7 s）→退火60°C（30 s）→72 ℃（15 s），40 個循環(huán)周期。RT-qPCR 引物為：miR-22-3p 上游引物為5’-AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGTA-3’,下游引物為5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC-3’；U6 上游引物為5’-ACTTCAGCAGCACATATACTAAAAA-3’,下游引物為5’-CGCTTCACGAATTTGCATGTCAT-3’。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法分析miR-22-3p的表達量。上述實驗單獨重復(fù)3次。

1.10 Western blotting 實驗 采用外泌體蛋白提取試劑盒進行提取外泌體中的總蛋白。BCA 法進行蛋白定量，蛋白樣品經(jīng)沸水中加熱變性后，取30 μg的蛋白進行SDS-PAGE 分離，采用濕轉(zhuǎn)法將分離后的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉于室溫下封閉2 h 后,分別加入CD63（1∶300）、TSG101（1∶300）和PLAP（1∶300）一抗，4 ℃搖床孵育過夜。TBST溶液清洗后，以辣根酶標記的二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST 溶液再次清洗后，均勻滴加ECL 發(fā)光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照。以上實驗單獨重復(fù)3次。

1.11 免疫組織化學(xué)染色（Immunohistochemical staining，IHC）取適量胎盤組織固定于4%甲醛溶液中，梯度酒精進行脫水，石蠟包埋，制成約4 μm的石蠟切片，采用EnVison 二步法檢測兩組胎盤組織中Netrin-1的表達。Netrin-1抗體稀釋比例為1∶200，其余操作參考說明書進行。染色結(jié)果判定采用結(jié)果判定采用Sinicrope[14]改良法，按胎盤細胞染色強度進行評分。所有標本均經(jīng)3位高級職稱的病理醫(yī)師通過雙盲法獨立評估。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料使用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗；計數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Speaman 相關(guān)性檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎盤外泌體的鑒定及miR-22-3p含量測定 TEM、NTA觀察結(jié)果顯示，從NC組與GDM組孕產(chǎn)婦外周血中提取的胎盤外泌體呈典型杯狀結(jié)構(gòu)，直徑約為30～150 nm（圖1A 和圖1B）。此外，Western blotting結(jié)果顯示，兩組受試者的胎盤外泌體均高表達外泌體標志性分子CD63、TSG101 和胎盤特異性蛋白耐熱堿性磷酸酶（PLAP）（圖1C）。RT-PCR 檢測上述外泌體中miR-22-3p 表達水平，結(jié)果顯示，與NC 組相比，GDM 組外泌體中miR-22-3p 含量顯著增加（P＜0.05）（圖1D）。

圖1 GDM胎盤外泌體高表達miR-22-3p

2.2 轉(zhuǎn)染后內(nèi)皮細胞中miR-22-3p 的表達 RTPCR 檢測結(jié)果顯示，與NC 組相比，轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic 的內(nèi)皮細胞中miR-22-3p 的表達明顯增加（P＜0.01），而轉(zhuǎn)染miR-22-3p inhibitor 的細胞中miR-22-3p的表達顯著降低（P＜0.01），miR-NC的細胞中miR-22-3p 的表達無明顯變化（P＞0.05），見圖2。

圖2 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后內(nèi)皮細胞中miR-22-3p的表達

2.3 miR-22-3p 對高糖環(huán)境下內(nèi)皮細胞增殖活性的影響 CCK-8實驗結(jié)果顯示，與NC組細胞相比，HG組，HG+miR-22-3p mimic組、HG+miR-22-3p inhibitor 和HG+miR-NC 組細胞的增殖活性均顯著增加（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+miR-22-3p mimic組內(nèi)皮細胞的增殖活性增加趨勢更為明顯（P＜0.05），而HG+miR-22-3p inhibitor 組細胞的增殖活性明顯降低（P＜0.05），HG+miR-NC 組無明顯變化（P＞0.05），見圖3。

圖3 miR-22-3p抑制高糖環(huán)境下內(nèi)皮細胞的增殖活性

2.4 miR-22-3p對高糖環(huán)境下內(nèi)皮細胞成管能力的影響 小管形成實驗結(jié)果顯示，與NC 組相比，HG組，HG+miR-22-3p mimic組、HG+miR-22-3p inhibitor和HG+miR-NC組內(nèi)皮細胞的小管形成能力均明顯增加（P＜0.05 或P＜0.01）；與HG 組相比，HG+miR-22-3p mimic 組細胞的小管形成能力顯著增加（P＜0.05），而HG+miR-22-3p inhibitor 組細胞的小管形成能力明顯降低（P＜0.05），HG+miR-NC 組無明顯變化（P＞0.05），見圖4。

圖4 miR-22-3p抑制高糖環(huán)境下內(nèi)皮細胞的成管能力

2.5 miR-22-3p 與Netrin-1 的靶向關(guān)系 生物信息學(xué)預(yù)測顯示，miR-22-3p 與Netrin-1 基因的3’-UTR具有靶向結(jié)合位點，見圖5A。雙熒光素酶基因報告實驗結(jié)果證實，與共轉(zhuǎn)染miR-NC+Netrin-1(WT)的細胞相比，共轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimic+Netrin-1(WT)的細胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）。而Netrin-1(MUT)的表達不受miR-22-3p 的影響，即miR-22-3p可直接與Netrin-1的3’-UTR結(jié)合并抑制其表達，見圖5B。

圖5 miR-22-3p靶向抑制Netrin-1表達

2.6 Netrin-1 在胎盤組織的表達及其與miR-22-3p的關(guān)系 IHC 染色觀察Netrin-1 在胎盤組織中的表達，結(jié)果表明，Netrin-1主要表達于絨毛內(nèi)的血管內(nèi)皮細胞中，少數(shù)分布于滋養(yǎng)細胞中，而與Normal 組相比，GDM 組Netrin-1 表達強度顯著降低（P＜0.05）。Speaman 相關(guān)系數(shù)分析顯示，在GDM 組胎盤組織外泌體中miR-22-3p 含量與Netrin-1 蛋白表達水平呈負相關(guān)關(guān)系（r=-0.74，P＜0.05），見圖6。

圖6 Netrin-1在GDM胎盤組織中表達顯著降低

3 討論

GDM 是最常見的妊娠并發(fā)癥之一，其在全球的發(fā)病率約為9%～15%。GDM 患者發(fā)生子癇、早產(chǎn)、剖腹產(chǎn)、巨大兒及遠期罹患2型糖尿病及心血管疾病的風(fēng)險均較正常妊娠女性顯著增加[1-2]。然而，盡管GDM具有如此高的發(fā)病率與誘發(fā)其他疾病的風(fēng)險，但其具體病理生理學(xué)機制仍不清楚。眾所周知，血管內(nèi)皮功能紊亂是GDM 特征性病理變化之一[4]。而GDM 的發(fā)展與妊娠胎盤向母體循環(huán)中釋放大量的激素、細胞因子、胎盤特異性蛋白、非編碼RNA 及細胞外囊泡等密切相關(guān)[15]。外泌體是納米級胞外囊泡，由特異性分子（如CD63、TSG101 等）包裹而成。由于這些微小囊泡能夠選擇性地將其包裹的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至特定的靶細胞中而參與影響后者的生物學(xué)行為，故外泌體能夠形成細胞間通訊的完整網(wǎng)絡(luò)[5]。已有大量研究證實，妊娠期胎盤組織能夠通過釋放外泌體來介導(dǎo)母胎界面的免疫調(diào)節(jié)、子宮螺旋動脈的重塑及胎盤屏障的形成等重要事件[16]，如在用低氧（1%的氧濃度）模擬子癇前期（pre-eclampsia,PE）環(huán)境下，滋養(yǎng)細胞分泌的外泌體能夠抑制血管內(nèi)皮細胞的遷移，并誘導(dǎo)其釋放高濃度的腫瘤壞死因子α（TNF-α），而后者又能損害內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)，阻礙螺旋動脈的重鑄，從而誘發(fā)PE 的發(fā)生[17]。在妊娠期免疫耐受的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，胎盤外泌體表達的活化NK 細胞受體NKG2D 的第二配體，即UL-16 結(jié)合蛋白（UL-16 Binding proteins,ULBP）可通過下調(diào)NK細胞、γδT細胞表面的NKG2D受體表達從而降低上述免疫細胞的細胞毒性，進而誘導(dǎo)母體對胎兒免疫耐受，維持正常的妊娠過程[18]。而在GDM中，最新的研究發(fā)現(xiàn)，GDM患者體內(nèi)胎盤外泌體分泌水平較較正常女性相比，其在孕早期升高2.2 倍，孕中期增加1.5 倍，孕晚期約增加1.8倍，這提示外泌體與GDM的病理生理學(xué)發(fā)生機制密切相關(guān)[19-20]。

本實驗首先通過分離妊娠孕產(chǎn)婦外周血中胎盤外泌體，分析發(fā)現(xiàn)miR-22-3p在GDM患者胎盤外泌體中的含量顯著高于正常對照組（P＜0.05），這與既往的研究結(jié)果一致[6]。為進一步明確miR-22-3p在GDM 中的具體作用，本課題組又采用脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達或敲低其在血管內(nèi)皮細胞中表達，并應(yīng)用高糖進行培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)染后的細胞以模擬GDM體內(nèi)環(huán)境，細胞功能實驗顯示，高糖環(huán)境能顯著促進內(nèi)皮細胞的增殖及小管形成能力，而上調(diào)細胞中miR-22-3p表達能夠顯著促進高糖的對內(nèi)皮細胞的上述促進作用，敲miR-22-3p 表達卻能顯著減弱高糖上述作用。隨后，應(yīng)用生物信息技術(shù)分析顯示miR-22-3p能夠與Netrin-1基因的3’-UTR具有靶向結(jié)合位點，雙熒光素酶基因報告實驗證實miR-22-3p能夠靶向抑制Netrin-1表達。

神經(jīng)導(dǎo)向因子Netrin-1 又名NTN1L，是一種分泌型蛋白，因最初發(fā)現(xiàn)其具有神經(jīng)引導(dǎo)作用而被命名，但隨著對其研究的深入，Netrin-1已被證實能夠在多種細胞中參與各種生物學(xué)過程，如細胞極性、黏附、遷移和血管生成。近年來，有學(xué)者報道Netrin-1同樣參與了胎盤的形成與發(fā)育，這提示Netrin-1 可能在胎盤相關(guān)的妊娠疾病中發(fā)揮重要作用[21]。而在GDM 中，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Netrin-1 能夠與其受體相互作用能夠保護血管內(nèi)皮細胞免受高糖刺激的損傷[22]，這提示在GDM中Netrin-1可能發(fā)揮保護性作用。本研究發(fā)現(xiàn)，胎盤外泌體高表達的miR-22-3p 能夠靶向調(diào)控Netrin-1 表達，且在GDM 胎盤組織中Netrin-1 表達較正常妊娠女性顯著降低，Spearman相關(guān)系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)胎盤外泌體中miR-22-3p含量與胎盤組織中Netrin-1表達水平呈負相關(guān)關(guān)系，亦進一步證實兩者的靶向調(diào)控關(guān)系。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)在GDM 胎盤外泌體中異常高表達的miR-22-3p 可能通過調(diào)控Netrin-1 蛋白表達，促進高糖對內(nèi)皮細胞的增殖及小管形成能力的上調(diào)作用，從而參與影響GDM 的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果從外泌體方面進一步補充了GDM的發(fā)病機制，為miR-22-3p/Netrin-1 軸有望成為GDM 新型臨床標志物和治療靶點提供了理論基礎(chǔ)。