黃芪甲苷對(duì)特發(fā)性胃癱大鼠c-kit蛋白表達(dá)及Cajal間質(zhì)細(xì)胞的影響*

姚 奇，周 茜，任東林，萬(wàn)星陽(yáng)△

（1.深圳市人民醫(yī)院肛腸外科，深圳 518020；2.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院肛腸外科，廣州 510655）

胃癱綜合征（gastroparesis）是指在無(wú)明確機(jī)械性梗阻的情況下出現(xiàn)的胃排空延遲，主要癥狀包括腹脹、惡心嘔吐、過(guò)早的飽腹感，其中特發(fā)性胃癱（idiopathic gastroparesis，IG）占50%以上[1]。Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Cajal,ICC）是一種特殊的間質(zhì)細(xì)胞，能夠產(chǎn)生生理慢波、控制胃腸道平滑肌的收縮和蠕動(dòng)，被認(rèn)為是胃腸道平滑肌的起搏細(xì)胞[2]。ICC 的表型或數(shù)量變化是多種胃腸動(dòng)力紊亂性疾病的主要因素，與IG 的發(fā)生密切相關(guān)[3]。胃腸道的ICC數(shù)量往往通過(guò)c-kit蛋白表達(dá)檢測(cè)來(lái)體現(xiàn)，c-kit 受體是胃腸道ICC 特異性標(biāo)志物[2,4-5]。中藥黃芪在胃癱中可發(fā)揮獨(dú)特的治療作用，并有研究表明，黃芪可通過(guò)刺激消化道ICC 的c-kit 表達(dá)，維持ICC的表型及數(shù)量穩(wěn)定[5-6]。本研究采用洛派丁胺構(gòu)建IG大鼠模型，經(jīng)黃芪甲苷灌胃處理后通過(guò)組織免疫熒光法檢測(cè)大鼠胃組織中c-kit的表達(dá)水平，評(píng)估其對(duì)ICC 數(shù)量及表型的影響，在動(dòng)物水平探究黃芪甲苷對(duì)IG的治療作用及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24 只SPF 級(jí)Sprague Dawley（SD）雄性大鼠，年齡6～8 周，體重100～130 g，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（粵）2016-0029。實(shí)驗(yàn)前穩(wěn)定飼養(yǎng)1周，控制動(dòng)物房溫度25 ℃，相對(duì)濕度50%，晝夜時(shí)間分明，不禁食、不禁水。

1.2 主要試劑與設(shè)備

黃芪甲苷（純度為98%，成都德斯特生物科技有限公司）用生理鹽水稀釋為73 mg/kg；CD117（ckit）兔單克隆抗體（14-1172-81，Introgen，美國(guó)）；山羊抗兔Cy3 熒光二抗（SA00009-1，Proteintech，湖北）；含40,6-二mid 基-2-苯基吲哚的熒光固定劑（ZLI-9557；ZSGB Bio，北京）；5%山羊血清封閉液（SL038，Solarbio，北京）；溫恒溫器（CM3050S；Leica Microsystems，Wetzlar，德國(guó)）；激光共聚焦掃描顯微鏡（TCS-SP8，徠卡系統(tǒng)顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司，上海）。

1.3 構(gòu)建胃癱大鼠模型

將24 只健康的SPF 級(jí)SD 大鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、黃芪甲苷低劑量組和黃芪甲苷高劑量組，每組6只。除空白組外，其余各組均給大鼠灌胃10 mg/kg 洛派丁胺，連續(xù)5 d，構(gòu)建IG 模型，空白組等體積生理鹽水灌胃。造模5 d后，大鼠體重、進(jìn)食量明顯降低、活動(dòng)減少[5]，模型組繼續(xù)灌胃洛派丁胺混懸液，低劑量組和高劑量組在造模的同時(shí)分別給予32 mg/kg、64 mg/kg黃芪甲苷進(jìn)行治療，空白組給予等體積生理鹽水，連續(xù)5 d。

1.4 觀察指標(biāo)

記錄每日大鼠的精神狀態(tài)、體重、進(jìn)食量、飲水量。胃癱大鼠模型構(gòu)建效果通過(guò)胃排空率及胃重量評(píng)估。

1.4.1 酚紅胃排空測(cè)定及胃稱(chēng)重 大鼠取材前禁食12 h，期間自由飲水。隨機(jī)每組選擇3 只大鼠，0.05%的酚紅溶液以500 μL/只的體積灌胃，30 min后水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，立即取全胃稱(chēng)重。胃浸泡于5 mL氫氧化鈉溶液和0.5 mL 三氯乙酸溶液中，3 000 r/min 的速度勻漿20 min，取上清液1 mL 加入4 mL 的氫氧化鈉溶液中，分光光度計(jì)測(cè)定胃排空值：

胃排空率（%）=（1-X/Y）×100

X：胃內(nèi)殘留酚紅溶液的吸光度

Y：酚紅與氫氧化鈉混合溶液的吸光度

1.4.2 胃組織結(jié)構(gòu)觀察及蘇木精―伊紅（HE）染色 隨機(jī)每組取3只大鼠，處死大鼠并解剖，自賁門(mén)上1 cm至幽門(mén)下1 cm，取全胃，組織分為兩份，一份固定于10%福爾馬林中，分級(jí)酒精脫水，石蠟包埋，一份冰凍于-80 ℃冰箱。切片厚度3～5 μm，切片置于載玻片上，脫蠟后用蘇木精、伊紅染色，用中性樹(shù)脂封片，蓋上蓋玻片，觀察組織形態(tài)。

1.4.3 組織免疫熒光染色 60 ℃烘箱內(nèi)烤片1 h，依次向石蠟切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ、95%酒精、85%酒精、75%酒精內(nèi)洗去多余石蠟。以檸檬酸鈉抗原修復(fù)液修復(fù)抗原，將0.3% Trition 和0.1% Tween 溶于PBS，通透細(xì)胞膜。25°C 環(huán)境下用5%山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)1 h，將標(biāo)本在4 ℃下與c-kit 一抗（1∶200）稀釋液孵育過(guò)夜，然后與Cy3 偶聯(lián)的山羊抗兔熒光二抗（1∶300）稀釋液孵育。在25 ℃的黑暗環(huán)境中放置1 h，PBS 清洗3 次后DAPI 孵育20 min。樣品用熒光固定劑固定，并在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察并拍照記錄。通過(guò)Image J軟件進(jìn)行熒光半定量，每組平均單位熒光密度使用GraphPad Prim6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4.4 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn) 冰凍大鼠胃組織解凍后除去黏膜部分，取胃固有肌層研磨、勻漿，加入RIPA 裂解液提取蛋白后定量蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h 后孵育一抗（1∶1 000）稀釋液，置于4 ℃冰箱過(guò)夜，第2 天孵育相應(yīng)的二抗（1∶5 000）稀釋液1 h后進(jìn)行ECL（Pierce）孵育后顯影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對(duì)胃癱大鼠胃重量及胃排空率的影響

大鼠造模第5 天，模型組和黃芪甲苷各劑量組小鼠可見(jiàn)飲水量和飲食量較空白組略微下降，但無(wú)明顯差異，各組大鼠的精神狀態(tài)也無(wú)明顯差異（均P＞0.05）。予黃芪甲苷干預(yù)5 d后取材可見(jiàn)，模型組胃重量對(duì)比空白組明顯增加，排空率顯著下降，模型構(gòu)建成功。與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組胃重量較模型組明顯下降，胃排空率明顯上升（P＜0.05），而黃芪甲苷低劑量組胃重量與排空率與模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組胃重量及胃排空率比較

表1 各組胃重量及胃排空率比較

與模型組比較，*P＜0.05。

2.2 胃癱大鼠模型胃組織結(jié)構(gòu)及Cajal細(xì)胞形態(tài)及分布

HE 染色可見(jiàn)黃芪甲苷可減輕胃癱大鼠胃組織中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕固有肌層的水腫、增厚。組織免疫熒光法染色后于熒光顯微鏡下觀察，c-kit表達(dá)集中于黏膜層和固有肌層（圖1A）。黏膜肌層多為圓形、環(huán)細(xì)胞核紅染，可識(shí)別為肥大細(xì)胞。Cajal 細(xì)胞多位于固有肌層，空白組Cajal 細(xì)胞形態(tài)與實(shí)驗(yàn)組類(lèi)似，單個(gè)細(xì)胞呈梭狀形態(tài)，環(huán)細(xì)胞核紅染，多個(gè)細(xì)胞呈網(wǎng)狀交織分布，緊密環(huán)繞神經(jīng)節(jié)。模型組c-kit 熒光強(qiáng)度明顯降低，Cajal 細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)邊緣圓鈍，少見(jiàn)交叉相連（圖1B）。

圖1 胃癱大鼠模型胃組織結(jié)構(gòu)及Cajal細(xì)胞形態(tài)及分布

2.3 黃芪甲苷對(duì)大鼠胃組織中Cajal細(xì)胞的影響

通過(guò)Image J 軟件對(duì)組織免疫熒光染色進(jìn)行熒光半定量統(tǒng)計(jì)，平均每個(gè)200×視野下固有肌層c-kit熒光強(qiáng)度比較，結(jié)果表明，與空白組比較，模型組平均熒光強(qiáng)度明顯下降（0.313±0.071vs0.532±0.084，P=0.016）；與模型組比較，高劑量組顯著回升（0.487±0.034vs0.313±0.071，P=0.049），而空白組無(wú)明顯差異（0.487±0.034vs0.532±0.084，P=0.631），低劑量組也無(wú)明顯差異（0.314±0.065vs0.313±0.071，P=0.999）。通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠胃固有肌層組織內(nèi)c-kit表達(dá)量，空白組平均c-kit表達(dá)最高，胃癱模型組c-kit 表達(dá)量明顯下降，黃芪甲苷可部分回調(diào)c-kit表達(dá)量，維持ICC表面c-kit的穩(wěn)定表達(dá)（圖2）。

圖2 黃芪甲苷對(duì)胃癱大鼠胃組織ICC改變的影響

3 討論

目前，IG最常用的治療方式為控制熱量及營(yíng)養(yǎng)攝入等生活習(xí)慣調(diào)節(jié)，促胃動(dòng)力劑、止吐藥劑神經(jīng)調(diào)節(jié)劑等藥物及在癥狀較為嚴(yán)重的情況下采用手術(shù)治療。研究報(bào)道，僅有約2%的胃癱患者嚴(yán)格遵從飲食調(diào)節(jié)建議，藥物使用也受肝臟、腎臟損害等副作用局限，IG 的治療效果差強(qiáng)人意，漫長(zhǎng)而反復(fù)的治療過(guò)程對(duì)IG 患者的身心健康和生活質(zhì)量都造成了較大的影響[6]。而中醫(yī)藥中許多復(fù)方制劑和針灸療法治療胃癱綜合征歷史悠久且具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在臨床應(yīng)用中取得了良好的效果[7-8]。然而，IG發(fā)病的機(jī)制十分復(fù)雜，中藥促胃動(dòng)力的機(jī)制涉及胃腸運(yùn)動(dòng)的幾乎所有的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)和因素，其作用機(jī)制并不明了。因此，本研究擬從傳統(tǒng)中草藥寶庫(kù)中挖掘治療胃癱的新型藥物，并探討其治療IG的潛在機(jī)制。

中醫(yī)認(rèn)為，胃癱屬于“嘔吐”、“反胃”的范疇，主要由于胃失和降、氣逆于上引起，其中醫(yī)辨證主要包括脾胃虛弱、脾腎陽(yáng)虛及胃陰不足。IG多為胃氣不足、功能減退的病理變化，因飲食不節(jié)、損傷胃氣，或素體虛弱、久病胃氣不復(fù)等所致。黃芪為豆科植物，主要藥理作用是“益氣固表”。黃芪用于治療胃癱綜合征歷史悠久，《傷寒雜病論》中提到，黃芪建中湯、防己黃芪湯、烏頭湯等黃芪類(lèi)經(jīng)方可用于胃癱綜合征，并經(jīng)研究證實(shí)[9]。ICC 的表達(dá)對(duì)胃癱、便秘等胃腸紊亂型疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生了重要影響，胃癱患者或動(dòng)物模型中均可見(jiàn)ICC 的數(shù)量顯著減少或表型改變。據(jù)報(bào)道，黃芪可增強(qiáng)肌條的收縮幅度，能使糖尿病性胃輕癱大鼠胃組織中ICC 形態(tài)和數(shù)量向正常轉(zhuǎn)化，使c-kit mRNA的表達(dá)數(shù)量增多[10]。這些研究表明，黃芪復(fù)方藥方可通過(guò)保護(hù)結(jié)腸ICC促進(jìn)胃動(dòng)力，治療IG，但其復(fù)方成分復(fù)雜，經(jīng)機(jī)體吸收、代謝后發(fā)揮治療作用的成分并不明確。隨著提取、純化技術(shù)的逐漸成熟，黃芪皂苷的成分之一，黃芪甲苷被認(rèn)為是黃芪皂苷中生物利用度最高的成分，黃芪甲苷或許是黃芪改善胃癱癥狀的關(guān)鍵[11]。

本研究結(jié)果顯示，造模后模型組排空率顯著下降，已成功構(gòu)建胃癱大鼠模型。實(shí)驗(yàn)組使用黃芪甲苷處理后，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可減少胃重量、增加胃癱大鼠胃排空率（P＜0.05）。組織免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同組中c-kit陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于黏膜層及固有肌層。根據(jù)c-kit 染色特性及細(xì)胞的形態(tài)可基本判斷，黏膜層中呈橢圓形的c-kit陽(yáng)性細(xì)胞為肥大細(xì)胞，ICC表現(xiàn)為多突觸的梭形結(jié)構(gòu)，相鄰ICC互相交織呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，集中分布于胃固有肌層。而模型組中，Cajal 細(xì)胞形態(tài)邊緣圓鈍，細(xì)胞之間少見(jiàn)交叉相連。熒光強(qiáng)度分析及蛋白質(zhì)免疫印跡可見(jiàn)，模型組固有肌層中的c-kit 表達(dá)量，較對(duì)照組明顯下降，黃芪甲苷可顯著增加胃固有肌層中的c-kit表達(dá)（P＜0.05）。c-kit是位于5號(hào)染色體位點(diǎn)上的原癌基因，它編碼kit受體（即CD117），是一種酪氨酸蛋白激酶受體，可被ICC 廣泛表達(dá)并通過(guò)與其天然配體干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）結(jié)合，調(diào)控MAPK、Wnt、NF-κB 等信號(hào)通路，決定著細(xì)胞的表型及分化，被認(rèn)為是胃腸道ICC 的特異性標(biāo)志物[12]。研究大量研究表明，便秘、腸易激綜合征等胃腸動(dòng)力紊亂疾病中，c-kit陽(yáng)性細(xì)胞顯著降低，ICC的表型及數(shù)量在維持一定胃腸動(dòng)力中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[13]。c-kit 表達(dá)增高可促進(jìn)細(xì)胞增殖，c-kit 的缺失可導(dǎo)致ICC 失去釋放慢波的特性，逐漸分化為平滑肌細(xì)胞[14]。并且，當(dāng)c-kit刺激增加，ICC向肌細(xì)胞分化的過(guò)程可被一定程度上逆轉(zhuǎn)，這種ICC 與肌細(xì)胞之間的雙向分化作用或是胃腸動(dòng)力紊亂治療的關(guān)鍵，尋找能夠維持ICC細(xì)胞c-kit表達(dá)的治療手段是本研究的主要目的。

總之，本研究通過(guò)動(dòng)物建模觀察黃芪甲苷的促胃動(dòng)力作用、胃組織病理結(jié)構(gòu)及c-kit陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可促進(jìn)ICC表達(dá)c-kit，一定程度上逆轉(zhuǎn)ICC 向肌細(xì)胞分化的趨勢(shì)，使胃癱大鼠胃組織中總體c-kit表達(dá)上升，明顯增加了固有肌層中c-kit陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，增加胃排空率，從而改善IG 癥狀。黃芪甲苷可有效促進(jìn)胃動(dòng)力，或可成為IG治療的新型單體藥物。