慢性HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞活化和耗竭水平與病程的相關(guān)性研究*

何天怡，邱文浩，劉 顯，彭麗珊，吳展帥，肖 健△

（廣西中醫(yī)藥大學(xué) 1.廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.免疫學(xué)與微生物學(xué)教研室，南寧 530200）

抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（antiroviral therapy，ART）是目前治療HIV-1 感染的有效方法，該治療方法成功降低了HIV-1病毒對(duì)人類的致命性傷害并向慢性疾病轉(zhuǎn)化，延長(zhǎng)感染者壽命并提高其生活質(zhì)量。ART療法通過清除有復(fù)制能力的感染細(xì)胞或大幅度提升淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)來控制HIV-1病毒對(duì)人體的損害，但卻始終無法將HIV-1 病毒完全根除。在對(duì)抗病毒過程中，CD8+T 細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），通過特異性殺傷被HIV-1 病毒感染的細(xì)胞來控制感染，因此CD8+T 細(xì)胞是治療HIV-1 感染的關(guān)鍵[1-2]。Kuse 等[3]研究表明，在HIV-1感染的急性期，CD8+T細(xì)胞在控制病毒復(fù)制方面發(fā)揮著重要作用，有助于感染初期的控制[3]。慢性激活和炎癥也會(huì)影響CD8+T細(xì)胞的分化和功能，這對(duì)控制HIV-1病毒復(fù)制至關(guān)重要。同時(shí)，Perdomo-Celis 等[4]發(fā)現(xiàn)，盡管ART 療法可以誘導(dǎo)部分免疫重建，但它對(duì)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能及其與炎癥狀態(tài)的關(guān)系尚不明確。并且經(jīng)過ART 治療后，CD8+T 細(xì)胞功能尚未恢復(fù)及其表面各類共刺激分子的相互作用使得清除病毒變得困難，這也是目前無法研制出有效治療HIV-1病毒疫苗的原因之一。目前的研究主要基于如何誘導(dǎo)強(qiáng)而有效的病毒特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)[5-6]。因此，探索不同感染狀態(tài)下HIV-1感染者外周血CD8+T細(xì)胞免疫狀態(tài)對(duì)揭示HIV-1感染機(jī)制具有重要意義。在免疫應(yīng)答過程中，HIV-1病毒復(fù)制增強(qiáng)與免疫激活、免疫細(xì)胞功能障礙、免疫細(xì)胞耗竭和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究通過檢測(cè)CD38、HLA-DR 和PD-1 在CD8+T 細(xì)胞的表達(dá)，從活化與耗竭的角度來探討CD8+T細(xì)胞在HIV-1感染過程中的變化及作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2019年1月至2020年12月在廣西疾病預(yù)防控制中心和瑞康醫(yī)院門診就診的未經(jīng)抗病毒治療的HIV-1 感染者96 例，其中男77 例，女19例；年齡17～86歲，中位年齡34歲，根據(jù)CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)分為3 組：（1）低CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)組53例，其中男45例，女8例，CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)＜350個(gè)/μL；（2）中CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)組21例，其中男18例，女3 例，CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)＞350～499 個(gè)/μL；（3）高CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)組22 例，其中男14 例，女8 例，CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)≥500 個(gè)/μL。接受抗病毒治療的HIV-1感染者27例（治療組），其中男17例，女10例，年齡7～59歲，中位年齡36歲。同期選取健康志愿者30例（健康組），HIV-1陰性，無其他免疫病史及其他免疫治療史。所有感染者排除乙肝、丙肝等其他病毒合并感染的情況，臨床檢查亦無其他疾病。本研究獲得醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象對(duì)研究?jī)?nèi)容知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑 CytoFLEX 流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫爾特公司），光學(xué)顯微鏡（德國(guó)徠卡公司）。Ficoll人淋巴細(xì)胞分離液（美國(guó)GE公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（賽默飛世爾儀器有限公司）；Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3、BV510 Mouse Anti-Human CD8、PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD38、Alexa Flour TM 700 Mouse Anti-Human HLA-DR、APC Mouse anti-Human CD279（PD-1）（美國(guó)BD公司）。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）的獲取 清晨空腹?fàn)顟B(tài)下分別抽取HIV-1感染者和健康對(duì)照組外周靜脈血4 mL 于EDTA-K2 真空抗凝管中，并加入與抗凝血等體積的RPMI-1640稀釋血液；將稀釋后的血液平鋪到Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液上（抗凝血-RPMI-1640:Ficoll 液=2∶1），用密度梯度離心法分離PBMCs，經(jīng)顯微鏡細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+T細(xì)胞CD38、HLA-DR、PD-1 的表達(dá) 取1.5 mL 離心管，加入100 μL 調(diào)整后的PBMCs懸液，分別加入帶有熒光標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD3 PB、CD8 BV510、CD38 PerCP-Cy5.5、HLA-DRAF700、PD-1APC適量，4 ℃避光孵育30 min；經(jīng)PBS洗滌后用多聚甲醛溶液重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Prism Graphpad8.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。采用Pearson 相關(guān)性分析法分析同一樣本參數(shù)之間的相關(guān)性，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIV-1感染者外周血CD8+T細(xì)胞CD38的表達(dá)情況 低CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)組（56.59%±10.55%）、中CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)組（55.42%±10.34%）、高CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)組（53.09%±8.18%）外周血CD8+T細(xì)胞CD38表達(dá)均高于治療組[（38.73±8.32）%]和健康組[（34.73±8.32）%]（均P＜0.01）；低、中、高CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)組外周血CD8+T 細(xì)胞HLA-DR 表達(dá)比較無明顯差異（P＞0.05），見圖1。

圖1 5組外周血CD8+T細(xì)胞CD38表達(dá)比較

2.2 HIV-1 感染者外周血CD8+T 細(xì)胞HLA-DR 的表達(dá)情況 低CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)組[（47.35±9.61）%]、中CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)組[（46.73±12.77）%]、高CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)組[（43.20±11.01）%]外周血CD8+T 細(xì)胞HLA-DR 表達(dá)均高于治療組[（29.47±7.53）%]和健康組[（13.38±5.87）%]（均P＜0.01）；治療組外周血CD8+T 細(xì)胞HLA-DR 表達(dá)高于健康組（P＜0.01）；低、中、高CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)組外周血CD8+T 細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)比較無明顯差異（P＞0.05），見圖2。2.3 HIV-1 感染者外周血CD8+T 細(xì)胞PD-1 的表達(dá)情況 低CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)組[（43.52±12.15）%]、中CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)組[（36.44±12.31）%]、高CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)組[（35.54±11.27）%]外周血CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)均高于治療組[（24.09±7.92）%]和健康組[（13.24±5.93）%]（均P＜0.01）；低CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)組外周血CD8+T 細(xì)胞PD-1 表達(dá)高于高CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)組（P＜0.05）；治療組外周血CD8+T 細(xì)胞PD-1表達(dá)高于健康組（P＜0.01），見圖3。

圖2 5組外周血CD8+T細(xì)胞HLA-DR表達(dá)比較

圖3 5組外周血CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)比較

2.4 HIV-1感染者CD38+HLA-DR+CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)情況 低CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)組[（49.55±11.16）%]、中CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)組[（45.42±9.46）%]、高CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)組[（41.45±7.64）%]外周血CD38+HLA-DR+CD8+T 細(xì)胞PD-1 的表達(dá)均高于治療組[（30.18±6.12）%]和健康組[（20.31±5.03）%]（均P＜0.01）；低CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)組外周血CD38+HLA-DR+CD8+T細(xì)胞PD-1 的表達(dá)高于高CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)組（P＜0.01）；治療組外周血CD38+HLA-DR+CD8+T 細(xì)胞PD-1的表達(dá)高于健康組（P＜0.01），見圖4。

圖4 5組外周血CD38+HLA-DR+CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)比較

2.5 相關(guān)性分析 未治療的HIV-1 感染者外周血CD8+T細(xì)胞CD38、HLA-DR表達(dá)與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)無明顯相關(guān)性（r=-0.1092，P=0.2897；r=0.0026，P=0.9798）；未治療的HIV-1感染者外周血CD8+T細(xì)胞PD-1 表達(dá)與CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.2419，P=0.0176）。

未治療的HIV-1 感染者CD38+HLA-DR+CD8+T細(xì)胞PD-1 的表達(dá)與CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.2714，P=0.0075）。

3 討論

在對(duì)HIV-1 病毒免疫反應(yīng)期間，抗原特異性CD8+T細(xì)胞被激活，增殖并獲得效應(yīng)功能，是抑制病毒復(fù)制和特異性殺傷被病毒損害的靶細(xì)胞的關(guān)鍵，因此CD8+T細(xì)胞在針對(duì)HIV-1感染的免疫反應(yīng)中起主要作用[7-8]。在HIV-1 感染過程中，CD38、HLADR，作為共刺激性分子在HIV感染中成為T細(xì)胞活化的表征[9]。有研究表明，由CD38和HLA-DR表達(dá)在CD8+T 細(xì)胞上的活化水平比在CD4+T 細(xì)胞更能將獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）和死亡的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)起來[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1未治療PBMCs 中CD8+T細(xì)胞CD38和HLA-DR的表達(dá)明顯高于治療組和健康組，治療組PBMCs中CD8+T細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)高于健康組。CD8+T 細(xì)胞免疫激活后CD38和HLA-DR 顯著升高，而CD8+T 細(xì)胞CD38 高表達(dá)是HIV 感染者疾病進(jìn)展的標(biāo)志之一[11-12]。在HIV-1感染過程中CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)值越低其PBMCs 中CD8+T 細(xì)胞CD38、HLA-DR 的表達(dá)越高，ART 治療后CD38 和HLA-DR 的表達(dá)降低仍高于健康組，表明ART 治療對(duì)HIV-1 病毒復(fù)制有一定抑制作用。但CD8+T細(xì)胞CD38和HLA-DR的過表達(dá)會(huì)逐漸影響機(jī)體免疫調(diào)節(jié)水平，如免疫系統(tǒng)不能及時(shí)下調(diào)異常的活化，其結(jié)果可能會(huì)引起自身免疫病的發(fā)生。隨著病程的進(jìn)展，表達(dá)在CD8+T細(xì)胞表面的負(fù)性刺激分子表達(dá)升高，這些分子的持續(xù)高表達(dá)會(huì)造成CD8+T細(xì)胞功能上的缺失，這個(gè)過程稱為耗竭[13]。

PD-1是免疫球蛋白超家族成員之一，表達(dá)在活化的T、B 淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面。PD-1 作為重要的免疫檢查點(diǎn)，在其效應(yīng)細(xì)胞過度活化時(shí)起到抑制作用，通過對(duì)免疫系統(tǒng)的負(fù)調(diào)節(jié)來抑制免疫細(xì)胞的激活。在免疫調(diào)節(jié)中PD-1作為靶點(diǎn)在病毒感染、自身免疫疾病等方面具有重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)，未治療的HIV-1感染者外周血CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)高于治療組和健康組，低CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)組PD-1表達(dá)高于高CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)組，治療組高于健康組。有研究表明，通過靶向PD-1通路增強(qiáng)細(xì)胞免疫對(duì)于HIV-1 治愈研究具有重要意義，CD8+T 細(xì)胞在初次感染后早期和在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒抑制治療下控制HIV-1復(fù)制至關(guān)重要[14]。在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療期間，PD-1 阻斷可降低病毒的復(fù)制能力和水平[15]。還有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PD-1在HIV-1特異性CD4+T細(xì)胞中上調(diào)，并與CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[16]。而本研究相關(guān)性分析表明，在CD8+T細(xì)胞中PD-1的表達(dá)與CD4 細(xì)胞計(jì)數(shù)也呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示PD-1 的高表達(dá)與疾病進(jìn)展相關(guān)，可被用作評(píng)估HIV-1 感染嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一。

同時(shí)，CD8+T 細(xì)胞是一系列具有不同功能的細(xì)胞群，為了進(jìn)一步探究分子間活化耗竭的相關(guān)性，本組檢測(cè)了CD38+HLA-DR+CD8+T 細(xì)胞PD-1 的表達(dá)水平。CD38 作為早期CD8+T 細(xì)胞活化的標(biāo)志，而HLA-DR 作為晚期CD8+T 細(xì)胞活化的標(biāo)志[17]，CD38+HLA-DR+是一群CD8+T細(xì)胞上高度活化的細(xì)胞，反映HIV-1病毒感染過程中免疫細(xì)胞的激活，提示免疫細(xì)胞處于高度活躍狀態(tài)，同時(shí)增強(qiáng)免疫細(xì)胞殺傷HIV-1 病毒的能力[18]。通過實(shí)驗(yàn)分析CD38+HLA-DR+CD8+T 細(xì)胞PD-1 的表達(dá)可以進(jìn)一步探討CD8+T 細(xì)胞活化和耗竭之間的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，未治療組PBMCs中CD38+HLA-DR+CD8+T細(xì)胞PD-1 的表達(dá)均高于治療組和健康組，表明低CD4+T 計(jì)數(shù)組PD-1的表達(dá)更高，且治療組高于健康組。提示在慢性HIV-1 感染過程中,CD8+T 細(xì)胞的持續(xù)活化會(huì)誘導(dǎo)PD-1的表達(dá)升高，適時(shí)下調(diào)因免疫紊亂而過度活化的CD8+T細(xì)胞，避免機(jī)體造成持續(xù)感染或機(jī)會(huì)感染的風(fēng)險(xiǎn)。在HIV-2 型病毒感染組中，CD4+T細(xì)胞CD38、HLA-DR 和PD-1 的共表達(dá)頻率升高[19]。通過檢測(cè)CD38、HLA-DR 和PD-1 的共表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，HIV-1感染組CD4+和CD8+T細(xì)胞活化和耗竭的平均百分比要高于健康對(duì)照組[20]。上述結(jié)果與本研究結(jié)果相一致。由于PD-1 有抑制T 細(xì)胞功能激活的作用故而在疾病早期，病毒通過其對(duì)免疫細(xì)胞功能的抑制作用使得CD8+T 細(xì)胞殺傷病毒的能力減弱，病毒逃逸且持續(xù)感染。隨著病情的進(jìn)一步加劇，在HIV-1的中晚期抑制性分子PD-1的表達(dá)升高可能是由于中晚期免疫細(xì)胞嚴(yán)重受損以及CD4+T 細(xì)胞恢復(fù)不足，CD8+T 細(xì)胞殺傷能力減弱有關(guān)。相關(guān)性分析表明，未治療HIV-1 感染者CD38+HLA-DR+CD8+T 細(xì)胞PD-1 的表達(dá)與CD4 計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。由此可以說明，CD38+HLADR+CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)和病程有關(guān)且隨著病程的進(jìn)展而加劇。

綜上所述，慢性HIV-1感染過程中CD38、HLADR 和PD-1 的表達(dá)均顯著增高。其中PD-1 的表達(dá)對(duì)CD8+T 細(xì)胞以及其免疫功能有著重要的影響，CD8+T 細(xì)胞的耗竭與活化誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。PD-1的高表達(dá)可能預(yù)示著疾病進(jìn)程的加劇，可以作為評(píng)估HIV-1 感染嚴(yán)重程度的指標(biāo)，有助于早期感染的控制，同時(shí)逆轉(zhuǎn)抑制性受體的過度表達(dá)或許會(huì)成為一個(gè)治療HIV-1感染的有效靶點(diǎn)。后續(xù)我們將選取其他分子表型或研究不同信號(hào)通路之間的關(guān)系進(jìn)一步探究CD8+T 細(xì)胞上各分子間活化耗竭的關(guān)系。