GLUT1蛋白對食管癌細胞順鉑耐藥性的作用及其機制研究*

張 曦，趙 堃，雷光焰

（陜西省腫瘤醫院胸部腫瘤外科，西安 710061）

食管癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，被列為第六大癌癥相關死亡原因（每年508 585 例死亡病例），占所有癌癥相關死亡的6.6%[1]。食管癌進展和化療耐藥是影響患者生存的重要因素。順鉑屬于鉑類藥物，是目前最普遍的食管癌一線治療方法。然而，順鉑耐藥已變得越來越普遍，是食管癌治療失敗的主要原因[2]。自噬是一種進化上保守的分解代謝過程。自噬過程中的氧化應激和炎癥改變在癌變過程中起著復雜的作用[3]。已有研究證明，自噬是順鉑處理耐藥食管癌細胞的一種保護機制，可維持細胞克隆存活能力[4]。葡萄糖轉運蛋白1（Glucose transporter 1，GLUT1）也被稱為促進葡萄糖轉運蛋白1，是一種促進葡萄糖轉運到哺乳動物細胞的單轉運蛋白。GLUT1 在人類癌癥中異常上調，促進癌癥的發生和進展[5]。已有研究表明，GLUT1 在耐藥人結腸腺癌細胞中表達上調，抑制GLUT1 的表達可提高耐藥人結腸腺癌細胞對阿霉素的敏感性[6]。目前，關于GLUT1在食管癌細胞耐藥性中的作用及其可能的作用機制尚不明確。因為，本研究旨在探究GLUT1在食管癌組織中的表達變化和對順鉑耐藥食管癌細胞的作用及其作用機制是否與調控自噬有關，以期為探明食管癌耐藥機制及開發新的治療策略提供新的科學資料。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人食管癌細胞株EC109 購自美國ATCC；順鉑購自美國Sigma 公司；CCK-8 試劑盒購自漢恒生物科技（上海）有限公司；RPMI-1640 培養基和Lipofectamine2000轉染試劑購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；GLUT1 特異性siRNA 序列（簡稱si-GLUT1）及其陰性對照（簡稱NC）購自上海吉瑪制藥技術有限公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix購自北京拜爾迪生物技術有限公司；GLUT1抗體購自英國Abacm；LC3B 和p62 抗體購自美國Cell Signaling Technology；Beclin1和GAPDH抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；EdU細胞增殖檢測試劑盒購自購自廣州市銳博生物科技有限公司；Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 臨床資料

收集2017 年4 月至2018 年7 月于陜西省腫瘤醫院進行手術切除的患者的食管癌組織及其癌旁組織29例，癌旁組織距離食管病變邊緣＞3 cm。其中男16 例，女13 例，年齡38～76 歲，平均（56.90±10.77）歲。組織標本置于-80 ℃條件下保存。病例納入標準：經病理學確診為食管癌；術前未接受任何形式的抗腫瘤治療。排除標準：患有其它消化系統疾病；合并其它類型的惡性腫瘤；合并重要臟器功能障礙；合并心腦血管疾病；合并自身免疫性疾病。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.3 細胞培養

取出凍存的EC109 細胞，用37 ℃溫水快速解凍，隨后離心棄上清。加入含10% FBS 的RPMI-1640培養基重懸細胞，將凍存管內細胞懸液轉移至培養皿中。細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞密度達到80%～90%時，胰酶液消化細胞，含10%FBS 的RPMI-1640 培養基重懸細胞，1:3比例傳代培養。

1.4 順鉑耐藥EC109/CDDP細胞株的建立[7]

以EC109細胞為親本細胞，采用順鉑間歇沖擊的方法構建順鉑耐藥EC109/CDDP 細胞株。向對數期生長的EC109細胞中加入順鉑（終濃度為1 μg/mL），細胞繼續培養24 h后，將細胞培養基更換為新鮮正常培養基。當EC109細胞恢復穩定生長后，再向細胞中加入順鉑（終濃度為1 μg/mL），發現有細胞死亡，則將細胞培養基更換為新鮮正常培養基。EC109 細胞反復加藥處理，直至細胞能在濃度為1 μg/mL順鉑培養基中正常生長。CCK-8試劑盒檢測細胞對順鉑的耐藥性，計算細胞順鉑的IC50，并則將該細胞命名為EC109/CDDP，細胞可進行傳代培養。

1.5 測定EC109細胞和EC109/CDDP細胞順鉑IC50

0.25%胰酶液消化對數期生長的EC109細胞和EC109/CDDP細胞，新鮮培養基重懸細胞，制成單細胞懸液。取100 μL EC109 細胞和EC109/CDDP 細胞懸液接種到96 孔板中，每孔5×103個細胞。細胞繼續培養24 h 后，將細胞培養基更換為新鮮培養基，同時加入不同濃度的順鉑處理細胞（0 μmol/L、0.062 5 μmol/L、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L 和160 μmol/L），每個濃度設置3 個重復。細胞繼續培養48 h。CCK-8試劑盒檢測各組細胞活力，細胞活力（%）=（不同濃度組OD 值/0 μmol/L組OD 值）×100%，GraphPad Prism5.0 軟件計算EC109細胞和EC109/CDDP細胞順鉑IC50。

1.6 細胞轉染

將對數期生長的EC109/CDDP細胞接種于6孔板中，每孔1×105個細胞，細胞置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。將細胞隨機分為空白對照組、NC組和si-GLUT1 組。按照分組，參照Lipofectamine2000 轉染試劑說明書，分別配制NC 和si-GLUT1轉染混合物并轉染細胞，空白對照組細胞加入等量PBS。另外，將細胞隨機分為空白對照組、順鉑組、順鉑+NC組和順鉑+si-GLUT1組。按照分組，參照Lipofectamine2000 轉染試劑說明書，分別配制NC和si-GLUT1轉染混合物并轉染細胞。再根據分組向細胞中加入順鉑（順鉑使用濃度通過CCK-8實驗決定，取對EC109/CDDP 細胞活力不產生影響的最大順鉑濃度10 μmol/L）。轉染后的細胞繼續培養48 h。隨后進行后續實驗操作。

1.7 RT-PCR 檢測組織和細胞中GLUT1 mRNA 表達

收集EC109 細胞和EC109/CDDP 細胞以及癌組織和癌旁組織，向組織和細胞中添加Trizol，提取細胞的總RNA。測定提取樣品的RNA 濃度，并將其逆轉錄成cDNA，作為RT-PCR 實驗中所需的模板。GLUT1上游引物：5’-CTGGGCAAGTCCTTTGAGAT-3’，GLUT1 下游引物：5’-GTGACACTTCACCCACATACA-3’；GAPDH 上游引物：5’-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3’，GAPDH 下游引物：5’-GCCCAATACGACCAAATCAGAG-3’。按照2×SYBR Green qPCR Master Mix說明書進行RTPCR 實驗，檢測GLUT1 mRNA 表達。反應程序：95 ℃、2 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，40 個循環；95 ℃、15 s；60 ℃、60 s；95 ℃、15 s。以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCt法計算GLUT1 mRNA表達。

1.8 Western blotting 檢測組織和細胞中GLUT1、LC3B、Beclin1和p62蛋白表達

收集EC109 細胞和EC109/CDDP 細胞以及癌組織和癌旁組織，蛋白裂解液冰上裂解細胞和組織，收集上清液，測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。每個樣品各取30 μg 蛋白加入SDS-PAGE 凝膠加樣孔內電泳分離，隨后將蛋白轉至PVDF 膜上。封閉液室溫封閉2 h，加入GLUT1（1∶500）、LC3B（1∶1 000）、Beclin1（1∶2 000）、p62（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）抗體稀釋液4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記二抗（1:5000）室溫孵育1 h。超敏ECL 發光液顯色，暗室曝光。Image J軟件進行蛋白條帶的灰度分析。

1.9 5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）實驗檢測EC109/CDDP細胞增殖

取轉染后的EC109/CDDP 細胞接種于96 孔板中，細胞數量5×103個/孔數量，培養12h 后，棄去細胞培養，根據EdU 細胞增殖檢測試劑盒說明書，向細胞中添加50 μmol/L EdU 溶液。細胞用4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.5%Triton X-100 穿透20 min。100 μL 1×Apollo?反應液室溫避光孵育30 min，DAPI 染核10 min。熒光顯微鏡觀察細胞發光情況（EdU 陽性著色表現為紅色熒光，DAPI 陽性著色表現為藍色熒光）。

1.10 流式細胞術檢測細胞凋亡

將對數期生長的EC109/CDDP細胞接種于6孔板中，每孔1×105個細胞，細胞置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。按照1.6步驟進行細胞轉染，細胞繼續培養48 h。棄去細胞培養基，加入胰酶液消化細胞，新鮮培養基終止消化，PBS 重懸細胞。加入200 μL的Annexin V-FITC結合液重懸細胞，5 μL的Annexin V-FITC混勻，加入10 μL的PI混勻，室溫避光反應20 min，立即上流式細胞儀檢測。

1.11 統計學方法

采用SPSS21.0 統計學軟件進行數據的統計分析。計量數據以均值±標準差（）表示，癌組織及其癌旁組織間的比較采用配對樣本t檢驗，EC109和EC109/CDDP組間的比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異具有統計學意義，則組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 癌組織和癌旁組織中GLUT1的表達

與癌旁組織相比，癌組織中GLUT1 mRNA 表達明顯升高（P＜0.05），GLUT1 蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 癌組織和癌旁組織中GLUT1的表達

2.2 順鉑耐藥食管癌細胞株的耐藥測定

不同濃度順鉑處理EC109 和EC109/CDDP 細胞，CCK-8 檢測細胞活力，結果顯示，與0 μmol/L EC109組相比，0.0625 μmol/L 和0.125 μmol/L EC109 組細胞活力比較差異無統計學意義（均P＞0.05），0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L 和160 μmol/L EC109 組細胞活力明顯降低（均P＜0.05）。與0 μmol/L EC109/CDDP 組相比，0.0625 μmol/L、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L 和10 μmol/L EC109/CDDP 組細胞活力比較差異無統計學意義（均P＞0.05），20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L 和160 μmol/L EC109/CDDP 組細胞活力明顯降低（均P＜0.05）。見圖2。EC109 細胞順鉑IC50=0.67 μmol/L，EC109/CDDP細胞順鉑IC50=35.76 μmol/L，EC109/CDDP細胞順鉑IC50 是EC109親本細胞的53.4倍。

圖2 CCK-8檢測不同濃度順鉑處理后的細胞活力

2.3 GLUT1在食管癌細胞中的表達

與EC109細胞相比，EC109/CDDP組細胞中GLUT1 mRNA 表達升高（P＜0.05），GLUT1 蛋白表達升高（P＜0.05）。見圖3。

圖3 GLUT1在食管癌細胞中的表達

2.4 敲低GLUT1增強食管癌細胞順鉑敏感性

與NC 組相比，si-GLUT1 組細胞中GLUT1 mRNA 表達和GLUT1 蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。與NC組相比，0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 和80 μmol/L 順鉑處理si-GLUT1組細胞活力明顯降低（P＜0.05），其中NC組細胞順鉑IC50=32.47 μmol/L，si-GLUT1 組細胞順鉑IC50=16.30μmol/L。與空白對照組相比，順鉑組EdU陽性細胞數差異無統計學意義（P＞0.05）；與順鉑+NC組相比，順鉑+si-GLUT1組EdU陽性細胞數明顯降低（P＜0.05）。見圖4。

2.5 敲低GLUT1促進順鉑耐藥食管癌細胞凋亡

與空白對照組相比，順鉑組EC109/CDDP 細胞凋亡率比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與順鉑+NC組相比，順鉑+si-GLUT1組EC109/CDDP細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。見圖5。

圖5 敲低GLUT1促進順鉑耐藥食管癌細胞凋亡

2.6 順鉑耐藥食管癌細胞中自噬水平升高

與EC109 細胞相比，EC109/CDDP 組細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1 蛋白表達明顯升高（均P＜0.05），p62蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。見圖6。

圖6 順鉑耐藥食管癌細胞中自噬水平升高

2.7 敲低GLUT1抑制順鉑耐藥食管癌細胞自噬

與空白對照組相比，順鉑組EC109/CDDP 細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1 蛋白表達明顯升高（均P＜0.05），p62 蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；與順鉑+NC 組相比，順鉑+si-GLUT1 組EC109/CDDP 細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1 蛋白表達明顯降低（均P＜0.05），p62 蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。見圖7。

圖7 敲低GLUT1抑制順鉑耐藥食管癌細胞自噬

3 討論

預計到2025 年，食管癌的患病率將增加140%[8]。盡管手術聯合放化療已顯示出一定的益處，但仍有相當一部分患者對化療或放療反應不佳。此外，化療期間常發生化療耐藥，這仍然是成功治療食管癌的主要障礙[9]。因此，闡明食管癌順鉑耐藥的發生機制，開發新的治療策略，對于改善食管癌治療現狀至關重要。

葡萄糖轉運蛋白（glucose transporter proteins，GLUTs）家族以組織特異性的方式促進葡萄糖在哺乳動物細胞質膜上的轉運。到目前為止，已經鑒定出14 種不同的GLUT 亞型[10]。GLUT1 在惡性腫瘤中的表達增加。癌細胞通常過度表達GLUT1，以應對生長因子的缺失，維持葡萄糖代謝并對凋亡產生抵抗[11]。已有研究表明，在葡萄糖缺乏的情況下，過表達GLUT1 通過增加線粒體超氧化物歧化酶和還原性谷胱甘肽活性，使前列腺癌細胞對葡萄糖缺乏誘導的細胞死亡的抵抗力增加[12]。同樣的，在食管癌細胞中，過表達GLUT1可促進腫瘤細胞葡萄糖消耗和細胞增殖[13]。目前，已有相關研究以GLUT1為靶點，進行了靶向抗癌藥物的研究，以克服腫瘤細胞多藥耐藥[14]。不難看出，GLUT1在腫瘤細胞耐藥方面具有重要作用。本研究結果顯示，GLUT1在食管癌組織和順鉑耐藥食管癌細胞中表達上調。敲低GLUT1 后，可提高食管癌細胞對順鉑的敏感性，抑制食管癌細胞增殖并促進細胞凋亡。該研究結果表明，GLUT1 促進食管癌細胞順鉑耐藥性的形成。

自噬在腫瘤發生、腫瘤進展和癌細胞對化療的抵抗中起著雙重作用。在癌癥初期，自噬限制了癌癥的惡性轉化，后來則促進了既定病變的生長和進展。自噬介導的腫瘤抑制在很大程度上歸因于通過選擇性自噬功能失調的線粒體抑制氧化應激和隨后的基因組不穩定性[15]。在治療過程中，自噬可以作為一種保護機制介導多藥耐藥。抑制自噬能使耐藥癌細胞重新敏感，增強化療藥物的療效[16]。已有研究表明，新型自噬抑制劑可通過抑制食管癌耐藥細胞系的自噬水平，增強其對長春新堿的敏感性[17]。此外，已有證據顯示，GLUT1通過促進自噬，參與乳腺癌細胞對他莫昔芬的耐藥性[18]。本研究結果顯示，順鉑耐藥食管癌細胞中自噬水平較親代食管癌細胞升高。順鉑處理耐藥食管癌細胞后，其自噬水平升高，提示自噬在耐藥食管癌細胞中可能發揮保護作用。為了進一步探討GLUT1 和自噬的關系，我們敲低了細胞內GLUT1，隨后發現細胞內自噬水平明顯降低。該結果提示，敲低GLUT1可能通過抑制自噬在順鉑耐藥食管癌細胞中發揮作用。

綜上所述，本研究結果表明，GLUT1 在食管癌組織中高表達。敲低GLUT1 可能通過抑制細胞自噬增加耐藥食管癌細胞對順鉑的敏感性。該研究結果為明確食管癌耐藥機制及開發新的治療策略提供了新的科學資料。