通心絡膠囊對熱射病大鼠心肌細胞線粒體自噬及PINK1/Parkin通路的影響*

哈斯葉提·吐爾遜，艾爾西丁·吾斯曼，吳長東

（新疆維吾爾自治區人民醫院急救中心，烏魯木齊 830001）

熱射病是最嚴重的中暑類型之一，可對機體內多個器官造成損傷。全身炎癥反應在熱射病的發生、發展過程中起著重要的促進作用。Tao等[1]研究證實，熱射病可引起大鼠海馬神經元凋亡和全身炎癥反應。通心絡膠囊具有通絡止痛、益氣活血的功效，臨床常用于預防冠心病、心絞痛，對脂質過氧化、炎癥反應等均具有抑制作用。Cai 等[2]研究報道，通心絡膠囊可抑制炎癥反應，對腦缺血性梗死具有良好的治療作用。線粒體自噬是細胞內受損線粒體被特異性降解的過程，是細胞的一種自我保護機制[3-4]。PINK1/Parkin通路是介導線粒體自噬的經典通路，在維持心臟的正常功能中起到重要作用[5-6]。本研究通過構建經典型熱射病大鼠模型探究通心絡膠囊對熱射病的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40 只SPF 級雄性SD 大鼠，7～9 周齡，體重（280±30）g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（京）2017-0006。

1.2 藥物和主要試劑 通心絡膠囊，石家莊以嶺藥業股份有限公司，批號：SY1 805001；大鼠白細胞介素（IL）-6 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒、大鼠IL-1β ELISA 檢測試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA檢測試劑盒，上海酶聯生物科技有限公司，貨號：ml102828、ml003057、ml 002859；兔抗p62抗體、兔抗Beclin1抗體、兔抗LC3抗體、羊抗兔IgG（HRP）抗體，艾博抗（上海）貿易有限公司，貨號：ab109012、ab210498、ab192890、ab6721；兔 抗PINK1 抗體、兔抗Parkin 抗體，賽默飛世爾科技（中國）有限公司，貨號：PA1-16604、702785。

1.3 動物分組及給藥 將40只大鼠隨機分為正常組、模型組、通心絡低劑量組、通心絡中劑量組、通心絡高劑量組，每組8 只。通心絡低、中、高劑量組分別給予0.1 g/kg[7]、0.3 g/kg、0.9 g/kg 通心絡（用生理鹽水溶解）灌胃，正常組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續7 d，末次灌胃24 h后進行造模。

1.4 熱射病大鼠模型的建立[8]除正常組大鼠，其他各組構建熱射病大鼠模型：腹腔注射1%戊巴比妥鈉（4 mL/kg）麻醉，待大鼠疼痛反射、角膜反射消失，并且呼吸、心律平穩后進行下一步操作。動物體溫維持儀35 ℃預熱，將麻醉大鼠置于其中的電熱毯上，進行5 min/次的核心體溫監測，當大鼠核心體溫超過40 ℃時即可視為熱射病造模成功。

1.5 血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平檢測 深度麻醉大鼠，腹主動脈采血，收集于離心管，靜置1 h，3 000 r/min 離心10 min，吸取上層血清，采用ELISA 法檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.6 心肌組織病理學觀察 處死大鼠，手術臺上迅速打開胸腔暴露心臟，于主動脈根部將心臟剪下并取出，生理鹽水沖洗干凈，濾紙拭干水分，剪取0.5 cm×0.3 cm×1 cm 的心肌組織，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，行蘇木精—伊紅（HE）染色。顯微鏡下觀察、拍照。

1.7 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡 取心肌組織石蠟切片，滴加蛋白酶K 工作液，37 ℃恒溫箱中20 min，PBS 洗滌；滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20 min，PBS洗滌；滴加TUNEL液37 ℃孵育1 h，PBS洗滌；切片放入用甲醇配制的3%過氧化氫溶液室溫避光孵育15 min阻斷內源性過氧化物酶，PBS 洗滌；滴加converter-POD 于37 ℃溫箱孵育30 min，PBS洗滌；DAB顯色，Harris蘇木精復染，終止顯色并洗滌后于顯微鏡下觀察。凋亡細胞核被染成棕黃色，正常細胞核呈藍色。心肌凋亡率=凋亡數/總細胞數×100%。

1.8 透射電子顯微鏡觀察線粒體自噬體 剪取新鮮的大鼠心尖組織1 cm×1 cm×1 cm，于戊二醛溶液中固定，PBS 漂洗，50%和70%乙醇脫水，再經各梯度丙酮脫水，環氧樹脂包埋劑包埋，行60 nm 切片，銅網撈片，進行飽和醋酸鈾染色，水洗，鉛染液浸染，水洗干燥，電鏡下觀察、拍照。

1.9 Western blotting法檢測PINK1/Parkin通路蛋白及自噬相關蛋白的表達 取100 mg 心肌組織，剪碎后加入裂解液，4 ℃下12 000 r/min 離心10 min，取上層蛋白，定量；每組取50 μg 進行SDS-PAGE 電泳分離蛋白，將蛋白轉至PVDF 膜；5%脫脂奶粉封閉，洗膜；加入一抗（p62、Beclin1、LC3、PINK1、Parkin、β-actin，均1∶500）4 ℃孵育過夜，洗膜；加入二抗（羊抗兔IgG抗體，1∶1 000）室溫孵育1 h，洗膜；ECL顯色，曝光，ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度值。以目標蛋白條帶灰度值與目的蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.10 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 與正常組比較，模型組、通心絡各劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，通心絡各劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，見表1。

表1 5組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較pg/mL，，n=8

與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

2.2 心肌組織病理改變 HE 染色結果顯示：正常組心肌組織結構正常，紋理清晰，心肌細胞呈梭形，細胞核居中，肌間未見炎性細胞；模型組心肌細胞排列紊亂，并且細胞濁腫，形態不規則，細胞間質可見炎性細胞浸潤；通心絡各劑量組相較于模型組，心肌細胞排列較為整齊，細胞腫脹數量減少，細胞間質炎性細胞浸潤減少，見圖1。

圖1 大鼠心肌組織HE染色（×200）

2.3 5 組心肌細胞凋亡率比較 與正常組比較，模型組、通心絡各劑量組心肌細胞凋亡率顯著上升（P＜0.05）；與模型組比較，通心絡各劑量組心肌細胞凋亡率顯著下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性，見表2。

表2 5組心肌細胞凋亡率比較，n=8

表2 5組心肌細胞凋亡率比較，n=8

與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

2.4 心肌細胞線粒體自噬發生情況 正常組線粒體結構正常，排列較好，無腫脹，幾乎不可見線粒體自噬；模型組線粒體腫脹變大，內部結構紊亂，線粒體嵴消失，呈現疏松、空泡化，可見大量疑似線粒體崩解形成的小泡（箭頭所示）；通心絡低劑量組有少量腫脹不明顯的線粒體出現，少量線粒體出現部分線粒體嵴，可見少量線粒體崩解形成的小泡（箭頭所示）；通心絡中劑量組大部分線粒體形態正常，且線粒體嵴明顯可見，能仍有疑似要崩解的線粒體（見箭頭）；通心絡高劑量組線粒體形態結構相對完好，內部結構有序，線粒體嵴密集，見圖3。

圖2 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡（×200）

圖3 透射電鏡圖（×30 000）

2.5 5組心肌組織自噬蛋白及PINK1/Parkin通路蛋白表達量比較 與正常組比較，模型組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，p62、PINK1、Parkin蛋白表達量顯著升高（P＜0.05），但Beclin1 蛋白表達無明顯差異（P＞0.05）；與模型組比較，通心絡各劑量組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，Beclin1、PINK1、Parkin 蛋白表達量顯著升高，p62 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，見圖4、表3、圖5。

圖4 Western blotting 法檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62、Beclin1自噬蛋白表達

表3 5組自噬相關蛋白表達量比較，n=8

表3 5組自噬相關蛋白表達量比較，n=8

與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

圖5 Western blotting法檢測PINK1和Parkin蛋白表達

3 討論

在高溫環境中，機體體溫調節功能出現障礙，核心體溫＞40 ℃，即出現熱射病[9]。熱射病可導致多器官損傷以及中樞神經系統障礙，死亡率較高。尋找熱射病的有效防治藥物，對于需要長期處于干熱環境中工作的人員具有重要意義。

通心絡膠囊為復方中藥，具有通絡止痛、益氣活血的作用，研究發現它可調節線粒體自噬水平，降低血脂，增強血管彈性，對心臟起到保護作用[10-11]。位庚等[12]研究報道，通心絡可減少大鼠心肌細胞凋亡。巫美紅等[13]研究報道，通心絡給藥可降低炎性因子的釋放，減少肥大細胞脫顆粒誘導的炎癥及心肌細胞損傷。本研究中，通心絡各劑量組較模型組心肌細胞病理改變顯著減輕，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低。提示通心絡膠囊可減輕炎性細胞浸潤程度，抑制炎性因子產生，緩解熱射病大鼠的心肌組織炎癥反應，對心肌細胞起到保護作用。

線粒體在心肌細胞中的含量十分豐富，其穩態對于心肌細胞的存活具有關鍵意義。線粒體自噬是針對受損線粒體的特異性自噬，該過程與線粒體分裂、融合保持動態平衡，共同維持細胞內線粒體的正常功能[14-15]。Li等[16]研究表明，線粒體自噬水平的高低可以通過線粒體自噬PINK1/Parkin 信號通路的激活程度來反應。PINK1 在正常情況下可進入線粒體內膜被降解，當細胞應激時，PINK1 因無法通過內膜而在線粒體外膜處積累，并招募Parkin蛋白啟動線粒體自噬，清除細胞內受損線粒體，維持細胞穩態[17]。本研究中，通心絡各劑量組與模型組比較PINK1、Parkin蛋白表達升高，提示通心絡膠囊能夠引起較強的線粒體自噬。LC3是非常重要的自噬蛋白，具有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形態，在自噬反應開始時，由LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化，因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高可表示自噬反應啟動[18]。Beclin1 蛋白廣泛介導自噬，與自噬水平呈正相關關系[19]。本研究發現，模型組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高，表明熱射病大鼠心肌細胞自噬增強；通心絡各劑量組與模型組比較，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin1蛋白表達進一步升高，再次表明通心絡膠囊能夠提升線粒體自噬水平。p62蛋白作為自噬配體蛋白，可錨定在待降解蛋白上，自噬發生時會被降解導致水平降低，因此，p62含量越少意味著自噬下游通暢[20]。而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1水平升高，同時p62 水平降低可表示自噬的啟動及下游均通暢，即自噬流通暢，單位時間內自噬降解量大。在本研究中，模型組與正常組比較，p62 蛋白量顯著升高，表明模型組雖然自噬體增多，自噬水平提高，但自噬流受到抑制并不通暢，單位時間內自噬降解量受阻，未能清除受損線粒體，心肌細胞損傷未得到修復；通心絡各劑量組與模型組比較，p62蛋白量顯著降低，表明通心絡膠囊能夠上調自噬流，加快自噬通量，發揮自噬對心肌細胞的保護作用。

綜上所述，通心絡膠囊可能通過激活PINK1/Parkin 信號通路，加強熱射病大鼠心肌細胞線粒體自噬，對心肌組織起到保護作用。