基于TXNIP/NLRP3信號通路探討紅景天苷對腸缺血再灌注損傷大鼠的作用機制*

鐘 旭，唐國強，劉 遷，黃 政，許 滔

（四川省自貢市第一人民醫院，自貢 643000）

腸道組織器官對缺血十分敏感，腸缺血再灌注（Intestinal ischemia-reperfusion，IIR）損傷是在腹部外傷、腸系膜血管缺血性疾病、小腸移植、失血性休克等情況引起的腸缺血基礎上，恢復血流后造成腸道損傷加重，甚至出現不可逆損傷的現象[1-2]，是臨床上較為常見的病理過程，IIR 損傷在許多臨床情況下被觀察到，如腸梗阻、絞窄、腸系膜動脈血栓形成等。IIR 后由于氧化應激反應和毒素移位，釋放大量炎癥因子，進而引起腸屏障功能障礙，造成遠隔器官損傷甚至誘發全身炎癥反應綜合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS）、多器官功能障礙綜合征（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[3]，導致死亡。硫氧還蛋白相互作用蛋白（Thioredoxin-interacting protein，TXNIP）是硫氧還蛋白的內源性抑制劑，硫氧還蛋白為人體內廣泛存在的活性氧（ROS）清除劑，具有抗氧化的作用。研究證明，氧化應激狀態下TXNIP 可以激活NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎性通路，而抑制TXNIP/NLRP3 信號通路可以改善脂多糖誘導的腎小管上皮細胞炎性損傷、腦缺血再灌注引起的遠端肺部組織損傷等。紅景天苷對大腦組織缺血再灌注[4-5]、肝缺血再灌注損傷[6]、腎缺血再灌注損傷[7]等具有保護作用。但是，基于TXNIP/NLRP3 信號通路分析紅景天苷對IIR 大鼠的作用機制，目前還未見相關報道。因此本研究建立大鼠IIR模型，分析紅景天苷對IIR大鼠的作用機制，為臨床上IIR的治療開拓思路。

1 材料與方法

1.1 動物

SD雄性大鼠（購買于西南醫科大學實驗動物中心）60只，SPF級，體重210～250 g。所有大鼠于動物房中飼養，自由飲食、飲水，12 h晝夜交替，相對濕度50%～60%，溫度22～24 ℃，保持動物房環境衛生。

1.2 主要試劑及儀器

純度98%紅景天苷標準品（貨號：MB6669，大連美侖生物技術有限公司）；HE 染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；大鼠IL-18、IL-10和IL-1β ELISA試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）試劑盒（南京建成生物工程公司）；TXNIP、NLRP3、Cleaved Caspase-1 p20和β-actin 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）；蛋白提取試劑盒、BCA 試劑盒（上海碧云天公司）等。全自動生化分析儀（型號PUZS-300，上海帝博思生物科技有限公司）；光學顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；酶標儀（美國Thermo 公司）；蛋白電泳儀、轉膜儀（美國Bio-Rad 公司）；蛋白成像系統（法國Fusion公司）；高速離心機（美國sigma公司）等。

1.3 方法

1.3.1 分組與給藥 60 只SD 雄性大鼠隨機分成5 組：假手術組（對照組）、模型組、紅景天苷低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組12只。紅景天苷臨用前用生理鹽水溶解，制成2 mg/mL的溶液，在模型制作前24 h、12 h和1 h，低、中、高劑量3組分別腹腔注射紅景天苷水溶液10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg，對照組與模型組以等量生理鹽水腹腔注射。

1.3.2 動物模型制備 制備大鼠IIR模型[8]：所有大鼠術前禁食12 h，自由飲水，將大鼠標記稱重，予腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，待麻醉起效后，將大鼠仰臥固定于操作臺，腹部備皮，碘伏消毒皮膚3遍并鋪無菌洞巾，于劍突下1 cm做腹部正中切口（1.5 cm 長），暴露腸系膜上動脈（Superior mesenteric artery，SAM），然后將之分離，對照組大鼠只分離動脈不夾閉，其它各組用滅菌無創動脈夾夾閉SAM，缺血成功的標準為夾閉處SAM搏動消失，腸道腫脹。夾閉SAM 90 min 后，開腹松開并取出動脈夾，恢復腸道供血，關腹，再灌注成功標準為夾閉處SAM 搏動恢復。再灌注2 h 后，進行樣本采集及檢測，其中對照組大鼠存活12 只（死亡0 只），模型組存活11 只（死亡1 只），低劑量組存活11 只（死亡1 只），中劑量組存活12 只（死亡0 只），高劑量組存活12只（死亡0只）。

1.3.3 大鼠血液和腸組織標本采集 再灌注2 h后，予大鼠過量麻醉，打開胸腔暴露心臟，經心尖穿刺取血4 mL，室溫靜置30 min 后離心，取上清液，-80 ℃冰箱保存。然后解剖大鼠，距回腸末端5 cm以上處剪取4 cm小腸組織。其中剪取1 cm，稱量腸濕重，然后置于110 ℃烤箱烘干24 h，稱量干重；剪取1 cm小腸組織放入4%多聚甲醛溶液固定后用石蠟包埋，用于后續小腸組織形態觀察；另剪下2 cm 腸段，冷生理鹽水沖洗干凈腸道糞便后，-80 ℃冰箱保存。

1.3.4 腸含水率計算 取約1 cm腸段，分析天平稱量腸濕重，然后置入110 ℃烤箱烘烤24 h，將組織塊烤至恒重后再稱量干重，計算腸含水率。腸含水率（%）=（濕重－干重）/濕重×100%。

1.3.5 大鼠腸組織病理損傷檢測 剪取2 cm 小腸組織放入4%多聚甲醛溶液固定后，常規脫水石蠟包埋制作切片，蘇木精—伊紅（HE）染色，光鏡下觀察小腸黏膜形態結構的變化，對腸黏膜損傷程度進行評價。

1.3.6 大鼠血清IL-18、IL-1β、IL-10 水平檢測 將大鼠血清置于4 ℃冰箱中解凍后，以ELISA 試劑盒檢測其中IL-18、IL-1β、IL-10水平，具體按操作說明書進行。

1.3.7 大鼠腸組織MDA、SOD 水平測定 分別采用硫代巴比妥酸法、黃嘌呤氧化酶法腸組織中MDA、SOD水平，嚴格按照操作說明書進行。

1.3.8 大鼠腸組織TXNIP/NLRP3 通路蛋白表達檢測 從-80 ℃冰箱取出各組小腸組織，稱重并記錄后加入裂解液剪碎，勻漿，離心后提取上清液，參照BCA試劑盒的說明書測定其中蛋白濃度，將各組蛋白濃度調至相同。各組樣品加入蛋白上樣緩沖液后煮沸變性，SDS-PACE 電泳分離蛋白，轉膜，置于5%脫脂牛奶溶液中，于搖床上室溫封閉1 h，條帶放入TXNIP（1:2 000）、NLRP3（1:1 000）、Cleaved Caspase-1 p20（1:1 000）和β-actin（1:1 000）一抗孵育盒，于4 ℃冰箱中孵育過夜，經TBST漂洗3次×10 min，加入羊抗兔二抗（1:3 000）溶液，于搖床上室溫孵育1 h，經TBST 再次漂洗3 次×10 min，發光液均勻滴于膜上顯影，蛋白成像系統觀察條帶并拍照，用Image-J圖像分析系統分析各組蛋白相對表達。

1.4 統計學方法

以SPSS 21.0 軟件對實驗數據進行統計分析，計量資料以平均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紅景天苷對IIR大鼠的小腸形態結構影響

對照組大鼠小腸組織無明顯腸黏膜損傷；模型組大鼠小腸黏膜損傷明顯，腸毛絨結構基本缺失，腸腺大量減少，炎性細胞浸潤固有層；低劑量組腸黏膜層中絨毛短而鈍，多見絨量組多數絨毛完整，毛細血管充血，固有層水腫，少量絨毛斷裂，可見炎性細胞浸潤；高劑量組偶見絨毛頂部脫落，毛細血管充血，腺體受損較輕，少量炎性細胞浸潤，見圖1。

圖1 各組腸組織形態學改變（×400）

2.2 腸含水率的變化

與對照組（71.53±4.62）相比，模型組腸含水率（88.24±8.05）顯著增高（P＜0.05）；與模型組相比，低劑量組（81.45±5.36）、中劑量組（79.43±3.14）、高劑量組（72.58±3.36）腸含水率均顯著降低（均P＜0.05），但低劑量組與中劑量組比較差異無統計學意義（均P＞0.05），高劑量組與低劑量組、中劑量組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 紅景天苷對IIR損傷大鼠血清炎性因子含量的影響

與對照組相比，模型組大鼠血清炎性因子IL-18、IL-1β 水平顯著上調，IL-10 水平顯著下降（均P＜0.05）；與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組血清炎性因子IL-18、IL-1β 水平下降，IL-10 水平升高（均P＜0.05），具有一定的劑量依賴性。見表1。

表1 各組間大鼠血清炎性因子水平比較

與對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與低劑量組相比，cP＜0.05；與中劑量組相比，dP＜0.05。

2.4 紅景天苷對IIR大鼠腸組織MDA、SOD水平影響

與對照組相比，模型組大鼠腸組織中MDA 水平顯著升高（P＜0.05），SOD 水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，低劑量、中劑量、高劑量組MDA水平顯著降低（均P＜0.05），SOD水平顯著升高（均P＜0.05），并呈劑量依賴性趨勢；見表2。

表2 各組大鼠MDA、SOD水平比較

表2 各組大鼠MDA、SOD水平比較

與對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與低劑量組相比，cP＜0.05。

2.5 紅景天苷對IIR 損傷大鼠腸組織TXNIP/NLRP3通路蛋白表達的影響

與對照組相比較，模型組大鼠腸組織中TXNIP、NLRP3、cleaved caspase-1 p20 蛋白表達均升高（均P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組TXNIP、NLRP3、cleaved caspase-1 p20 蛋白表達顯著降低，并呈劑量依賴性趨勢（均P＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠腸組織中TXNIP、NLRP3、Caspase-1蛋白表達圖

表3 紅景天苷對IIR 大鼠腸組織TXNIP/NLRP3 通路蛋白表達的影響

表3 紅景天苷對IIR 大鼠腸組織TXNIP/NLRP3 通路蛋白表達的影響

與對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與低劑量組相比，cP＜0.05；與中劑量組相比，dP＜0.05。

3 討論

本研究中復制的IIR模型大鼠小腸黏膜損傷明顯，腸毛絨結構基本缺失，腸腺大量減少，炎性細胞浸潤固有層，腸含水率較對照組顯著增加，說明IIR損傷可造成大鼠腸黏膜組織嚴重損傷。紅景天苷提取自紅景天根莖，是一種生物水平成分，具有抗疲勞、抗氧化、清除自由基等作用[9]。研究顯示紅景天苷在移植腎術后可明顯減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷[7]。本研究結果發現，隨著紅景天苷劑量的增加，大鼠小腸組織損傷逐漸減輕，結構逐漸趨于正常，大鼠小腸含水率較模型組顯著降低，說明紅景天苷能夠在一定程度上緩解大鼠IIR對機體造成的傷害，與姜黃素[10]作用效果類似，推測紅景天苷對IIR 大鼠小腸損傷的改善可能與其抗氧化、清除自由基的作用有關。

腸道缺血一段時間后，組織已適應低血流、低氧環境的生理代謝過程，再灌注時血流突然恢復，可激活血管內巨噬細胞，釋放過量氧自由基，誘發內皮損傷，腸道缺氧、腸壁通透性增加，激活炎性因子，致使腸道菌群發生移位，炎性細胞因子廣泛釋放，激活機體程序性凋亡，引發腸道嚴重受損[11-12]。研究表明，促炎因子和抑炎因子的失衡是導致炎癥，引起IIR損傷的重要原因。另外，缺血缺氧可導致氧自由基生成，引起脂質過氧化反應增強，大量氧自由基的釋放也是引起IIR損傷的重要病理生理機制[13]。MDA是脂質過氧化反應的產物，其含量與自由基引起的細胞損傷程度有關；SOD為清除氧自由基的重要酶，其水平的高低反映機體抗氧化的能力。本研究中，與對照組相比，模型組大鼠血清炎性因子IL-18、IL-1β 水平及MDA 水平顯著上調，抑炎因子IL-10及SOD水平顯著降低，表明IIR損傷可引起炎癥反應，誘導氧化應激損傷。研究顯示，抑制炎癥和氧化應激反應是減輕缺血再灌注的有效治療途徑[14-15]。已有報道，紅景天可通過抑制氧化損傷、炎癥因子分泌及細胞凋亡，改善缺氧復氧引起的星形膠質細胞損傷[16]。本研究發現，與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組血清IL-18、IL-1β 水平及MDA 水平逐漸下降，抑炎因子IL-10 及SOD 水平逐漸增高，說明紅景天苷可降低IIR 損傷大鼠血清的IL-18、IL-1β水平，并具有一定的劑量依賴性。提示在IIR 損傷中，紅景天苷可通過抗炎及減輕氧自由基對腸組織的氧化性損傷，發揮保護腸黏膜的功能。

研究表明，TXNIP∕NLRP3信號通路是介導氧化應激和炎癥反應的重要信號通路之一，參與多種器官缺血再灌注損傷的發生和發展[17-18]。TXNIP為氧化還原蛋白的內源性抑制劑，通過與其結合可抑制其對ROS的清除作用，因此TXNIP水平過高與氧化應激損傷有關。另外，當機體受到損傷，ROS 水平較高時，氧化還原蛋白被氧化，此時TXNIP 與之解離，與NLRP3 蛋白結合并誘導NLRP3 炎性小體活化，釋放促炎癥因子IL-1β 等，進一步加重炎癥反應[19]。本研究結果顯示，模型組大鼠較對照組腸組織中TXNIP、NLRP3、cleaved caspase-1 p20 蛋白表達均升高，說明IIR 后大鼠腸組織TXNIP∕NLRP3 信號通路活化，誘發氧化應激反應和炎癥反應，參與IIR損傷病理過程。倪海強等在小鼠腎小管上皮細胞缺氧復氧模型中發現，抑制TXNIP介導的NLRP3通路活化，下調X 盒結合蛋白1 表達可減輕細胞氧化應激和炎性損傷[20]。二甲雙胍可抑制TXNIP 的表達以及NLRP3 的活化，降低氧化應激和炎癥反應，改善IR 所致腸屏障損傷[21]。本研究還發現，紅景天苷低、中、高劑量組較模型組腸組織中TXNIP、NLRP3、cleaved caspase-1 p20 蛋白表達顯著降低，且劑量越高，蛋白表達水平越低，說明紅景天苷可抑制TXNIP∕NLRP3信號活化，并具有一定的劑量依賴性，推測紅景天苷減輕IIR 腸損傷的作用可能通過減輕氧化應激水平，抑制TXNIP∕NLRP3信號通路及其下游炎癥反應實現。

綜上，紅景天苷可能通過減輕氧化應激反應，抑制TXNIP∕NLRP3信號通路及其下游炎癥反應，減輕IIR 損傷，為臨床上治療IIR 損傷開拓了思路，但紅景天苷抑制TXNIP∕NLRP信號通路對腸缺血再灌注引起的遠端器官損傷是否有保護作用仍需進一步研究。