低氧條件下自噬激活對成骨細胞分化的影響*

王雅雯，陳灼庚，程亞楠，李 娜，王彬娉

（中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院 海南省口腔醫學中心口腔綜合科，海口 570208）

氧供不足時細胞的新陳代謝會受到影響[1]。骨折時局部血流的中斷會造成中央氧分壓下降，而種植窩的預備及植體的植入所造成種植體與牙槽骨之間周圍微環境的改變與骨折相似，會導致成骨細胞的代謝失調，影響植體周圍骨結合[2-3]。自噬是一類參與細胞新陳代謝的生物學行為，而氧化應激反應、氧供不足或者機體生理、病理的改變都有可能誘發細胞自噬[4]。種植窩的預備和植體植入易造成的局部氧供的減少，但能否導致細胞自噬的發生，改變局部骨的新陳代謝，進而影響植體周圍的骨結合，目前尚不清楚。本課題組前期研究發現，缺氧能早期誘導成骨細胞發生自噬[5]，為此，本實驗采用低氧濃度體外培養人成骨細胞系hFOB1.19，制備成骨細胞低氧環境模型，檢測自噬蛋白和成骨分化蛋白的表達，探討自噬與成骨分化的關系，進一步明確種植體骨結合機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 人種屬hFOB1.19成骨細胞系（美國ATCC）。胎牛血清（FBS，澳大利亞Hyclone 公司）；DMEM/F12（巴西Gibco 公司）；微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）、Beclin 1、雷帕霉素哺乳動物靶蛋白（mTOR）、轉化生長因子-β（TGF-β）、骨形態發生蛋白-2（BMP-2）、Runt相關轉錄因子2（Runx2）抗體（美國Cell Signaling 公司）；Goat Anti-Rabbit IgG 二抗（美國Southern Biotech 公司）；GAPDH 一抗（上海康成公司）。

1.2 細胞培養 將hFOB1.19 成骨細胞常規培養于含10%FBS 的DMEM/F12 培養液，置于34 ℃、飽和濕度、5%CO2細胞培養箱中培養，每24 h 換液一次。待細胞鋪滿培養瓶底90%時，胰蛋白酶消化、傳代。取第2代成骨細胞進行實驗。

1.3 實驗分組 將hFOB1.19成骨細胞常規接種于25 m2培養瓶中，待細胞鋪滿瓶底90%時，更換為34 ℃、5%CO2、2%氧濃度培養細胞[6]，分別培養3 h、6 h、12 h、24h、48 h。以常規培養的細胞為對照組，低氧條件下培養不同時間（3 h、6 h、12 h、24 h、48 h）的細胞為實驗組。

1.4 Western blotting 法檢測自噬相關蛋白和成骨分化相關蛋白的表達 收集各組細胞，提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量，取20 μg蛋白，加5×上樣緩沖液；10%的SDS-PAGE，80 V 或120 V 恒壓電泳50 min 分離蛋白，低溫條件下，100 V 恒壓濕轉120 min 使蛋白轉移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h；加入一抗LC3、Beclin 1、mTOR、TGF-β、BMP-2、Runx2（均1∶1 000）于4 ℃下孵育過夜；TBST 緩沖液洗滌10 min×3 次，室溫下孵育二抗（1∶1 000）1 h，TBST 緩沖液洗滌10 min×3 次，ECL 發光、顯影。用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，方差不齊時用Tamhane T2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 低氧誘導對成骨細胞自噬的影響低氧條件下不同時間LC3-Ⅱ、Beclin1 蛋白表達均高于對照組（P＜0.01），表達量峰值出現在低氧誘導后的48 h；作為自噬負向調節因子的mTOR激酶，其表達呈現先升高后降低，3 h 時mTOR 蛋白表達最高，隨后其表達均低于對照組（P＜0.01），見圖1、表1。

圖1 Western blotting法檢測LC3、Beclin1、mTOR蛋白表達

表1 低氧條件下培養不同時間自噬相關蛋白表達量變化

表1 低氧條件下培養不同時間自噬相關蛋白表達量變化

與對照組比較，*P＜0.05；與本組培養3 h 比較，aP＜0.05；與本組培養6 h 比較，bP＜0.05；與本組培養12 h 比較，cP＜0.05；與本組培養24 h比較，dP＜0.05。

2.2 低氧對成骨細胞分化的影響低氧條件下不同時間TGF-β蛋白相對表達量均高于對照組，最高值出現在12 h（P＜0.01）；BMP-2 蛋白表達在3 h 時低于對照組（P＜0.01），之后升高，48 h 時表達量最高（P＜0.01），而Runx2的表達則是隨著時間的延長不斷升高（P＜0.01），見圖2、表2。

表2 低氧條件下培養不同時間成骨分化蛋白表達量變化

表2 低氧條件下培養不同時間成骨分化蛋白表達量變化

與對照組比較，*P＜0.05；與本組培養3 h 比較，aP＜0.05；與本組培養6 h 比較，bP＜0.05；與本組培養12 h 比較，cP＜0.05；與本組培養24 h比較，dP＜0.05。

圖2 Western blotting法檢測TGF-β、BMP2和Runx2蛋白表達

3 討論

氧是生物生長發育必不可少的物質，但是來源不同的組織和細胞對氧分壓的改變表現不盡相同，呈現兩極分化的結果[7]。植體植入造成局部的類骨折現象導致該區域氧分壓的降低，形成低氧的環境[2-3]。有研究表明，局部氧分壓的下降在早期能促進成骨分化，但是隨著作用時間的延長，則可能產生抑制的效果[8]。自噬作用細胞維持內環境穩定的一個重要生理過程，在氧供的不足可被激活，維持細胞生命。在牙種植體植入的早期低氧環境下，成骨細胞的分化是否與細胞自噬活化相關，是本研究的重點內容。本研究通過調整細胞hFOB1.19 氧分壓，模擬局部的低氧環境，初步探討低氧環境下成骨細胞的自噬改變對細胞分化的影響。

當細胞處于營養缺乏、氧化應激或氧供不足時，自噬活化被啟動，胞漿內出現大量游離雙層膜結構，稱為自噬泡。在自噬活化過程中，LC3對自噬泡延伸和自噬體形成必不可少，LC3-Ⅱ含量高低反映自噬泡數量的多少，LC3-Ⅱ被視為自噬體檢測的特異性標記分子。Beclin1 是最典型的自噬調控基因，是自噬膜形成和延伸的關鍵因子。研究表明，在氧分壓下降甚至是缺氧環境下，前骨細胞MLOA5 和骨樣細胞MLO-Y4 的LC-II 的蛋白表達升高，細胞自噬被激活[9]。本研究結果提示，在低氧的早期，LC3和Beclin 1的表達均已上調，細胞的自噬就已被激活，隨著作用時間的延長，自噬活性持續存在并不斷升高，并在48h時達到峰值，表明低氧能誘導hFOB1.19 成骨細胞的自噬活化。自噬的發生受自噬信號所調控，而mTOR信號通路是最早被研究的自噬信號通路，而mTOR 激酶為自噬信號“閥門分子”，對自噬起負調控作用[10]。在本研究發現，mTOR蛋白的表達與對照組相比，先升高后降低，提示了在低氧狀態下，mTOR 激酶作為自噬的負調控基因，在自噬啟動后的表達在初期可能由于其它信號通路的作用，短暫的出現升高的情況，但是隨著作用時間的延長，自噬活化程度的提升，mTOR的表達也逐漸下降，我們推測，mTOR信號通路有可能介導的成骨細胞的自噬活化，但mTOR蛋白是不是其中的關鍵蛋白還有待后期進一步實驗加以證實。

骨的新陳代謝由兩部分構成，即成骨細胞參與的骨形成和破骨細胞誘導的骨吸收，這兩種代謝模式相互作用，處于一個平衡狀態，同時受到多種因素，例如各種生長因子的影響[11-12]。TGF-β是骨新陳代謝的重要調節因子，能促進前體成骨細胞的早期分化[13]。本研究結果顯示，在研究時間內，低氧狀態下誘導成骨細胞自噬發生時，TGF-β 蛋白的表達也上調，提示自噬的活化可能影響成骨細胞的新陳代謝，介導了成骨細胞的分化。成骨細胞作為骨形成的主要功能細胞，在分化成熟過程中會受到一系列轉錄因子的調控[14]。Runx2是一個成骨特異性轉錄因子，是成骨細胞分化的關鍵蛋白，因為其具有促進和調節成骨分化的重要功能，研究中常被作為成骨經典指標指示細胞成骨分化程度。但是，Runx2的表達受到參與成骨細胞分化的多種生長因子，如轉化生長因子-β、骨形態發生蛋白等的調控[15-17]。在骨形成早期，BMP-2 作為重要的成骨性分化因子，不僅參與成骨細胞的分化和骨形成過程，同時還刺激Runx2 的產生，繼之促進成骨細胞的分化和成熟[18-20]。自噬對細胞的分化是促進或是抑制作用在不同間充質干細胞或成骨細胞中有不同的表現。大量的體內及體外研究表明，在不同的條件作用下，例如高糖、山奈酚、維生素K2、雷尼酸鍶、敲除ATG7等可誘導骨髓間充質干細胞或成骨細胞發生自噬，維持骨穩態環境，而運用3-MA抑制成骨細胞自噬能降低Runx2和BMP-2的蛋白表達[21-24]。本研究發現，低氧條件下成骨細胞自噬增強，同時Runx2和BMP-2 蛋白表達升高，提示低氧條件下，自噬的活化可能誘導成骨細胞分化蛋白表達。隨著作用時間的延長，Runx2 和BMP-2 蛋白表達升高，在自噬活性最高時，Runx2 和BMP-2 蛋白表達也呈現峰值，且Runx2的表達呈現時間依賴性，進一步提示自噬活性程度影響成骨細胞的分化，激活成骨細胞自噬活性可能促進細胞分化。

種植體植入造成植體周圍局部氧分壓的改變，可能影響著種植體與周圍骨組織的骨結合。然而，低氧環境中成骨細胞自噬活性的改變對細胞的分化的影響仍不清楚。本課題研究的結果初步顯示，低氧能夠激活成骨細胞自噬活性，調控TGF-β、Runx2以及BMP-2表達，從而促進細胞分化，mTOR自噬信號通路有可能參與了成骨細胞的自噬活化。在此基礎上，本課題組將通過干預mTOR激酶表達觀察TGF-β、Runx2及BMP-2表達的變化，探討mTOR自噬信號通路在成骨細胞自噬活性中的作用及其對細胞分化的影響，進一步明確種植體骨結合的內在機制。