circ_0056618通過靶向miR-1281調控胃癌HGC-27細胞的增殖和凋亡

王 威，周培華，鄧 瑞

（湖北省十堰市國藥東風總醫院胃腸外科，十堰 442000）

胃癌是消化系統常見惡性腫瘤，具有較高的發病率和死亡率。早期胃癌診斷率低，一經確診多數患者已處于晚期，盡管胃癌臨床治療策略不斷完善，但胃癌治愈率仍較低[1]。因此，揭示胃癌發生、進展的分子機制對提高其診斷、治療效率具有重要的臨床價值。環狀RNA（circRNA）是新發現的具有共價閉合環狀結構的非編碼RNA，其表現出組織和發育階段特異性表達，并通過與微小RNA（miRNA）分子結合間接調控下游靶基因穩定和翻譯在調節細胞活性和多種病理過程中起重要作用[2-3]。有報道指出，circ_0056618 表達增加與胃癌患者的生存時間呈負相關，抑制circ_0056618 表達顯著降低胃癌細胞的增殖和轉移能力[4]。然而，circ_0056618在胃癌中功能和潛在作用機制并未完全闡明。miR-1281 是與骨肉瘤、乳腺癌進展有關的致癌miRNA，miR-1281可誘發內質網應激促進骨肉瘤細胞凋亡，miR-1281還可促進乳腺癌進展[5-6]。序列分析顯示，miR-1281 是circ_0056618的靶基因，但circ_0056618靶向miR-1281對胃癌細胞增殖和凋亡的影響尚見相關的研究報道。本研究以人胃癌組織和胃癌細胞系HGC-27為研究對象，探討circ_0056618和miR-1281 在HGC-27 細胞增殖和凋亡中的作用和分子機制，旨在為胃癌靶向治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 選取2017 年1 月至2018 年10 月于我院進行手術切除的30 例胃癌組織標本和對應的癌旁組織（距離腫瘤邊緣5 cm 的正常胃黏膜組織）。所有患者術前均未接受放化療等其他療法。其中男21例，女9例。標本離體后立即置于液氮中在-80 ℃超低溫冰箱保存。本實驗獲得我院倫理委員會批準且所有患者均知情同意。

1.1.2 細胞和實驗試劑 人胃癌細胞系HGC-27購于中國典型培養物保藏中心；逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II 購于大連TAKARA 公司；miRNA逆轉錄試劑盒、miRNA qPCR試劑盒購于美國Gene-Copoeia 公司；細胞計數試劑盒（CCK-8）、膜聯蛋白V-異硫氫酸熒光素（Annexin-V-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒購于北京索萊寶生化科技公司；兔源p21、細胞周期素D1（CyclinD1）、B 細胞淋巴瘤（Bcl-2）、Bcl 相關x 蛋白（Bax）抗體購于美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 實時定量PCR（RT-qPCR）檢測circ_0056618和miR-1281表達 采用TRIzol試劑提取胃癌組織、癌旁組織樣本中總RNA，通過逆轉錄試劑盒將總RNA 逆轉錄為cDNA，用SYBR Premix Ex Taq II 檢測circ_0056618 表達水平。circ_0056618 上游引物5’-GAACCCA-CCCCACCTCTAC-3’，下游引物5’-CTTCCCCGG-GATAAACAAACC-3’；內參GAPDH 上游引物5’-GAAGAGAGAGACCCTCACGCTG-3’，下游引物5’-ACTGTGAGG AGGGGAGATTCAGT-3’。利用miRNA 逆轉錄試劑盒合成cDNA，按照miRNA qPCR 試劑盒說明進行PCR反應和miRNA定量分析。miR-1281上游引物5’-ACACTCCAGCTGGG-TCGCCTCCTCC-3’，下游引物5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGGAGAGG-3’；U6 上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCA-GCAC ATATA-3’，下游引物5’-AAATATGGAACG-CTTCACGA-3’。2-ΔΔCt方法計算circ_0056618 和miR-1281 相對表達量。

1.2.2 細胞培養和分組 HGC-27 細胞采用RPMI-1640 培養基在37 ℃、含5%CO2的培養箱中常規培養。傳代比例為1:3，換液頻率為每周2～3次。以2×105個/孔的密度將對數期HGC-27細胞接種6孔板，利用Lipofectamine 2000 進行瞬時轉染，分為si-NC組（轉染si-NC）、si-circ_0056618 組（轉染si-circ_0056618）、miR-NC 組（轉染miR-NC）、miR-1281 組（轉染miR-1281 mimics）、pcDNA組（轉染pcDNA）、pcDNA-circ_0056618組（轉染pcDNA-circ_0056618）、si-circ_0056618+anti-miR-NC 組（共轉染si-circ_0056618 和anti-miR-NC）、si-circ_0056618+antimiR-1281 組（共轉染si-circ_0056618 和anti-miR-1281）。收集轉染48 h 細胞，RT-qPCR 檢測轉染合格后進行后續實驗。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞活力 將HGC-27細胞以3×103個/孔的密度接種96 孔板，在培養24 h、48 h、72 h 時按照10 μL/孔加入CCK-8 溶液，常規培養2.5 h，酶標儀檢測各樣品在450 nm 處的光密度（OD）值。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 使用結合緩沖液調整HGC-27 細胞為1×106個/mL 的單細胞懸液，取100 μL 細胞懸液加入流式管中，加入Annexin-VFITC、PI染色液，孵育15 min后，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測增殖、凋亡相關蛋白表達 RIPA蛋白提取試劑提取HGC-27細胞總蛋白。將蛋白裂解液與上樣緩沖液混合，用SDS/PAGE 凝膠分離細胞蛋白，然后轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。4 ℃下5%脫脂奶將膜封閉12 h，并與一抗室溫下孵育2 h。然后與二抗在室溫下孵育1 h。暗室顯色后，凝膠成像系統分析目的蛋白相對表達量。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因實驗 將對數期HGC-27細胞以5×104個/孔密度將接種在24孔板中，共轉染WT-circ_0056618、MUT-circ_0056618 報告質粒和miR-1281 mimics、miR-NC至HGC-27細胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統測定轉染48 h 后HGC-27 細胞相對熒光素酶活性。同時，利用將pcDNA、pcDNA-circ_0056618、si-NC、si-circ_0056618 分別轉染HGC-27 細胞，記為pcDNA 組、pcDNA-circ_0056618 組、si-NC 組、si-circ_0056618組，RT-qPCR檢測轉染48 h后細胞中miR-1281相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計軟件對數據進行統計分析。每組設置3個平行實驗，獨立重復3次，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。Pearson 相關分析用于評價胃癌組織中circ_0056618 和miR-1281 表達的相關性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circ_0056618 和miR-1281 在胃癌組織中的表達

胃癌組織中circ_0056618表達水平較癌旁組織顯著升高（P＜0.05），miR-1281 表達水平較癌旁組織顯著降低（P＜0.05）。胃癌組織中circ_0056618和miR-1281表達水平呈負相關關系，見圖1。

圖1 circ_0056618和miR-1281在胃癌組織中的表達

2.2 抑制circ_0056618表達對胃癌HGC-27細胞增殖和凋亡的影響

RT-qPCR檢測顯示，轉染si-circ_0056618后HGC-27 細胞circ_0056618 表達較轉染si-NC 顯著降低（P＜0.05），提示轉染si-circ_0056618 可抑制circ_0056618 表達，見圖2A。CCK-8 檢測顯示，sicirc_0056618 組HGC-27 細胞活力顯著低于si-NC組（P＜0.05），見圖2B。流式細胞術分析顯示，sicirc_0056618組HGC-27細胞凋亡率顯著高于si-NC組（P＜0.05），見圖2C。Western blotting 檢測顯示，si-circ_0056618組HGC-27細胞CyclinD1和Bcl-2蛋白表達低于si-NC 組（P＜0.05），p21 和Bax 蛋白表達高于si-NC組（P＜0.05），見圖2D。

圖2 抑制circ_0056618表達對胃癌HGC-27細胞增殖和凋亡的影響

2.3 circ_0056618靶向調控miR-1281的表達

生物信息學軟件在線分析結果表明，circ_0056618與miR-1281之間存在互補結合的核苷酸序列，見圖3A。雙熒光素酶報告實驗結果表明，miR-1281 mimics 與WT-circ_0056618 共轉染后HGC-27細胞熒光素酶相對活性較miR-NC 和WT-circ_0056618 共轉染顯著降低（P＜0.05），見圖3B。RTqPCR 分析結果表明，pcDNA-circ_0056618 組HGC-27細胞中miR-1281表達較pcDNA組顯著降低（P＜0.05）；si-circ_0056618 組HGC-27 細胞中miR-1281表達較si-NC組顯著升高（P＜0.05），見圖3C。

圖3 circ_0056618靶向調控miR-1281的表達

2.4 miR-1281 過表達對胃癌HGC-27 細胞增殖和凋亡的影響

RT-qPCR 檢測顯示，轉染miR-1281 mimics 后HGC-27 細胞miR-1281 表達較轉染miR-NC 顯著升高（P＜0.05），見圖4A。CCK-8檢測顯示，miR-1281組HGC-27 細胞活力顯著低于miR-NC 組（P＜0.05），見圖4B。流式細胞術分析顯示，miR-1281組HGC-27 細胞凋亡率顯著高于miR-NC 組（P＜0.05），見圖4C。Western blotting 檢測顯示，miR-1281 組HGC-27 細胞CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表達低于miR-NC 組（均P＜0.05），p21 和Bax 蛋白表達高于miR-NC組（P＜0.05），見圖4D。

圖4 miR-1281過表達對胃癌HGC-27細胞增殖和凋亡的影響

2.5 下調miR-1281 表達逆轉了抑制circ_0056618表達對胃癌HGC-27細胞增殖和凋亡的作用

相較于si-NC 組，si-circ_0056618 組HGC-27 細胞miR-1281p表達顯著升高，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達、細胞活力顯著降低，p21 和Bax 蛋白表達、凋亡率顯著升高（均P＜0.05）；相較于si-circ_0056618+anti-miR-NC組，si-circ_0056618+anti-miR-1281組HGC-27細胞miR-1281p表達顯著降低，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達、細胞活力顯著升高，p21和Bax蛋白表達、凋亡率顯著降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 下調miR-1281表達逆轉了抑制circ_0056618表達對胃癌HGC-27細胞增殖和凋亡的作用

3 討論

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，具有發病率和治愈率低的特點，已成為嚴重威脅人類健康的重要的公共衛生問題。近年來，circRNA 在腫瘤進展中的生物學作用已引起研究廣泛關注。多項研究證實，circRNA參與胃癌細胞增殖、分化、凋亡和轉移等各種生物學過程，是腫瘤進展的關鍵調節劑，在胃癌中具有診斷和治療靶點潛力[7-8]。本研究重點分析circ_0056618 在胃癌中的作用，結果顯示胃癌組織中circ_0056618表達顯著增加，轉染si-circ_0056618抑制circ_0056618 表達顯著降低胃癌細胞HGC-27的增殖活力并誘導細胞凋亡，與Li 等[4]研結論基本吻合。Zheng 等[9]研究證實抑制circ_0056618 通過上調miR-206 的作用在結直腸癌中具有抗增殖、遷移和血管生成作用。此外，Ghafouri-Fard S 等[10]報道通過檢測circ_0056618 等circRNA 的水平對結直腸癌患者臨床預后具有預測作用。CyclinD1 通過與周期素依賴性蛋白激酶（CDKs）結合在細胞周期從G0/G1 期向S 期轉變中具有促進作用，而P21 則通過抑制CyclinD1/CDKs 活性阻礙細胞周期進展，研究指出，隱丹參酮通過上調P21 表達、抑制CyclinD1 表達對胃癌細胞增殖、周期進展具有顯著的抑制作用[11]。本研究中，抑制circ_0056618 表達顯著降低HGC-27 細胞中CyclinD1 蛋白表達并升高p21蛋白表達，表明抑制circ_0056618表達可能通過調控細胞周期發揮抗增殖作用。Bcl-2 家族在腫瘤進展或抑制線粒體功能障礙引發的內在凋亡通路中發揮關鍵作用，該家族中促凋亡成員Bax 和抗凋亡成員Bcl-2之間的平衡是決定細胞命運的作用因素[12]。有研究證實，異歐前胡素通過增加Bax 表達同時降低Bcl-2 表達來誘導胃癌細胞凋亡[13]。本研究中抑制circ_0056618 表達顯著抑制Bcl-2 蛋白表達，促進Bax蛋白，與其促凋亡作用一致。以上研究提示抑制circ_0056618表達在胃癌中發揮抗增殖和促凋亡作用。

眾所周知，miRNA參與基因表達調控和各種腫瘤生物學過程，circRNAs 通過與miRNA 相互作用從而調節基因轉錄和細胞活性，在腫瘤進展中具有重要作用[14]。本研究證實miR-1281與circ_0056618靶向結合，且circ_0056618 對miR-1281 表達具有負調控作用。早期研究顯示，膀胱癌樣本中miR-1281表達降低[15]。LINC01857 可能通過下調miR-1281表達來降低神經膠質瘤細胞的增殖和侵襲性能[16]。本研究結果顯示，胃癌組織中miR-1281 表達降低，miR-1281 表達與circ_0056618 表達呈負相關關系。miR-1281 過表達顯著抑制HGC-27 細胞CyclinD1和Bcl-2蛋白表達以及增殖活力，促進p21和Bax蛋白表達并誘導細胞凋亡。與本研究類似，Liu等[17]證實Lnc-GIHCG 在胃癌中的促增殖和轉移作用可能與下調miR-1281 有關。此外，本研究發現，抑制miR-1281 表達還可顯著逆轉circ_0056618 抑制對HGC-27 細胞增殖、凋亡以相關蛋白表達的影響。進一步證實，circ_0056618 通過負調控miR-1281 進而影響胃癌細胞增殖和凋亡。

綜上所述，本研究證實抑制circ_0056618 表達通過負調控miR-1281能夠抑制胃癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，為胃癌患者的治療提供了潛在的靶點。