血清NGAL、VEGFA、Periostin水平與哮喘—慢性阻塞性肺疾病重疊綜合征患者肺功能的關(guān)系*

余長芳，余海霞，譚裕堯，李 昊，歐仕穎

（甘孜藏族自治州人民醫(yī)院，康定 626000）

哮喘—慢性阻塞性肺疾病重疊綜合征（ACOS）以哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）并存為特征，較單純COPD 患者急性發(fā)作頻率更高，肺功能下降更快，病死率更高的疾病[1]，因此早期識別ACOS至關(guān)重要，但目前仍缺乏可靠的生物學(xué)指標(biāo)。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（NGAL）是一種由中性粒細(xì)胞分泌的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)代謝、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等作用[2]。近期研究顯示NGAL可促進(jìn)COPD患者體內(nèi)上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促使和加重氣道重塑[3]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一類調(diào)節(jié)血管增殖和重塑的細(xì)胞因子，現(xiàn)有研究顯示VEGF 在哮喘合并COPD 患者中明顯升高，可作為COPD 合并哮喘的診斷指標(biāo)[4]。血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）作為VEGF 家族最具代表性的成員，是否參與ACOS 發(fā)病尚不清楚。骨膜蛋白（Periostin）是成束蛋白家族成員，可與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)肺基質(zhì)形成[5]，參與哮喘、特發(fā)性肺纖維化等呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生及病情進(jìn)展[6]，但Periostin 在ACOS 的報道并不多見。鑒于此，本研究擬探討血清NGAL、VEGFA、Periostin 水平與ACOS 患者肺功能的關(guān)系以及NGAL、VEGFA和Periostin 聯(lián)合檢測診斷ACOS 的價值，旨在為臨床診治ACOS提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2017 年1 月至2020 年1 月甘孜藏族自治州人民醫(yī)院收治的哮喘患者（哮喘組）98 例、COPD患者（COPD 組）109 例和ACOS 患者（ACOS 組）93例為研究對象，哮喘符合2016 年版《支氣管哮喘防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，COPD符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013 年修訂版）》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，ACOS符合2012年ACOS診斷共識中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[9]。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～80 周歲；（2）患者均知曉本研究內(nèi)容，均進(jìn)行血清生化指標(biāo)以及肺功能檢測；（3）入組兩周前均未出現(xiàn)呼吸道感染事件。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并肺部腫瘤、肺囊腫、肺部感染等其它疾病；（2）合并肝腎功能嚴(yán)重障礙、急性腎損傷、泌尿系感染、冠心病、惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病；（3）近期服用抗生素、免疫抑制劑等影響本研究指標(biāo)藥物。另隨機(jī)選擇100 例同期于本院門診體檢健康者為對照組，均排除呼吸系統(tǒng)疾病。本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 血清NGAL、VEGFA、Periostin水平檢測

所有患者入組后24 h 內(nèi)均采集空腹靜脈血5 mL（對照組于體檢當(dāng)日采血），取上清液置于TGL-15M 臺式微量高速冷凍離心機(jī)（湖南平凡科技有限公司）4 ℃3 000 r/min 離心15 min（離心半徑10 cm），取血清-80 ℃保存待檢。快速解凍清樣品，采用ALISEI 全自動酶標(biāo)儀應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清NGAL、VEGFA 和Periostin 水平，試劑盒購自北京科美東雅生物技術(shù)有限公司。本試驗均由本院檢驗中心完成，試劑盒批內(nèi)和批間變異系數(shù)控制在10%以內(nèi)。抽取血標(biāo)本樣品10%進(jìn)行平行試驗，由同一人完成，誤差控制在5%以內(nèi)。

1.3 肺功能檢測

所有患者入組后24 h內(nèi)完成肺功能評估（對照組于體檢當(dāng)日檢查），采用Master Screen 肺功能儀（德國耶格公司）檢測前吸入200 μg 沙丁胺醇，15 min 后測量第1 秒用力呼氣容積（FEV1），計算FEV1與用力肺活量（FVC）的比值（FEV1/FVC）、FEV1占預(yù)計值百分?jǐn)?shù)（FEV1%pred）。以上由本院呼吸科2名10年以上相關(guān)工作經(jīng)驗醫(yī)師操作，結(jié)果判讀由雙人獨立完成，誤差控制在1%以內(nèi)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（）表示，多組建比較采用單因素方差分析，組間兩兩對比采用LSD-t檢驗，以率(%)表示計數(shù)資料采用χ2檢驗或校正χ2檢驗。Pearson 相關(guān)系數(shù)描述NGAL、VEGFA、Periostin 水平與FEV1、FEV1/FVC、FEV1%pred 之間相關(guān)性，受試者工作特征（Receiver operator characteristics curve，ROC）曲線分析NGAL、VEGFA、Periostin 診斷ACOS 的效能，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，校正后α=0.008。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線資料比較

四組患者的年齡、性別以及體質(zhì)量指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），COPD 組和ACOS組吸煙比例高于哮喘組和對照組（P＜0.008），哮喘組和對照組吸煙比例比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。哮喘組、ACOS 組過敏史比例高于COPD 組和對照組（P＜0.008），COPD 組和對照組過敏史比例比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 四組患者基線資料比較

2.2 四組血清NGAL、VEGFA和Periostin水平

四組血清NGAL、VEGFA 和Periostin 水平具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。ACOS組血清NGAL、VEGFA和Periostin水平高于COPD 組、哮喘組和對照組（P＜0.05）。COPD組血清NGAL、VEGFA水平高于哮喘組和對照組（P＜0.05），哮喘組和對照組血清NGAL、VEGFA 水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。哮喘組血清Periostin 水平高于COPD 組和對照組（P＜0.05），COPD 組血清Periostin 水平高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 四組血清NGAL、VEGFA、Periostin水平比較

表2 四組血清NGAL、VEGFA、Periostin水平比較

與對照組比較，aP＜0.05；與哮喘組比較，bP＜0.05；與COPD組比較，cP＜0.05。

2.3 四組患者肺功能指標(biāo)比較

ACOS 組FEV1/FVC、FEV1低于哮喘組和對照組（P＜0.05），與COPD 組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），哮喘組FEV1/FVC、FEV1低于對照組（P＜0.05）。ACOS 組和哮喘組FEV1%pred 低于對照組（P＜0.05），高于COPD 組（P＜0.05），ACOS 組和哮喘組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表3。

表3 四組FEV1、FEV1/FVC、FEV1%pred比較

表3 四組FEV1、FEV1/FVC、FEV1%pred比較

與對照組比較，aP＜0.05；與哮喘組比較，bP＜0.05；與COPD組比較，cP＜0.05。

2.4 ACOS患者血清NGAL、VEGFA和Periostin水平與肺功能的關(guān)系

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ACOS患者血清NGAL、VEGFA 和Periostin水平與FEV1/FVC、FEV1%pred 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），與FEV1無明顯相關(guān)關(guān)系（P＞0.05），見表4。

表4 NGAL、VEGFA、Periostin 水平與FEV1、FEV1/FVC、FEV1%pred相關(guān)系數(shù)r,P

2.5 NGAL、VEGFA、Periostin聯(lián)合檢測診斷價值

ACOS 以哮喘和COPD 并存為特征，并和COPD 狀態(tài)有密切關(guān)聯(lián)，故進(jìn)一步探討NGAL、VEGFA、Periostin 等指標(biāo)對COPD 患者并發(fā)ACOS的診斷價值，各指標(biāo)的單獨應(yīng)用：以ACOS組為陽性樣本，以COPD 組為陰性樣本，建立ROC 曲線診斷分析模型：被分析指標(biāo)按樣本總水平數(shù)值范圍劃分為若干個組段，建立ROC曲線（折線）。再以軟件擬合的ROC 曲線讀取Youden 指數(shù)最大值點，對應(yīng)計算理論閾值和靈敏度、特異度。經(jīng)ROC 分析知：該指標(biāo)具有一定的診斷價值，曲線下面積（AUC）（95%CI）分別為0.699（0.637～0.761）、0.731（0.673～0.790）、0.720（0.655～0.784）。各指標(biāo)的聯(lián)合應(yīng)用：采用SPSS 軟件的聯(lián)合應(yīng)用ROC 理論模式（LogP 模式：對各單獨應(yīng)用指標(biāo)進(jìn)行綜合回歸，建立Logistic 預(yù)測/診斷評估模型，再依據(jù)所得回歸系數(shù)B，歸一化加權(quán)計算并對應(yīng)處理各樣本資料，并據(jù)其進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用的ROC 分析）。聯(lián)合應(yīng)用對COPD 患者并發(fā)ACOS的診斷價值：AUC（0.95%CI）為0.902（0.871～0.943）。提示其診斷效能均比單一指標(biāo)均有明顯提高，見表5和圖1。

表5 NGAL、VEGFA、Periostin單獨和聯(lián)合檢測診斷ACOS的效能

圖1 NGAL、VEGFA 和Periostin 對COPD 患者并發(fā)ACOS的診斷的ROC圖

3 討論

ACOS 被認(rèn)為是一種特殊表型的COPD，隨著人口老齡化進(jìn)展，ACOS發(fā)病率不斷攀升，據(jù)報道老年人群ACOS 發(fā)病率在15%～55%[1]。ACOS 的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，可能與哮喘和COPD吸煙、氣道高反應(yīng)性、感染、過敏反應(yīng)等共同始動因素或危險因素相關(guān)。由于目前ACOS 診斷標(biāo)準(zhǔn)尚不統(tǒng)一，臨床尚缺乏統(tǒng)一的病情評估標(biāo)準(zhǔn)，因此早期系統(tǒng)全面評估ACOS 對疾病診斷、病情評估均具有重要意義。

NGAL 是載脂蛋白家族成員，主要由中性粒細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞分泌，NGAL 水平可反映呼吸道上皮損傷和中性粒細(xì)胞肺內(nèi)浸潤程度。NGAL通過與中性細(xì)胞釋放的基質(zhì)金屬蛋白酶9結(jié)合促使中性粒細(xì)胞炎癥和呼吸道上皮損傷[10]，NGAL 促進(jìn)支氣管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，促使COPD 氣道重塑[3]。Bchir 等[11]報道顯示，NGAL 水平可反映與吸煙相關(guān)的COPD 全身炎癥狀態(tài)，鑒別吸煙和非吸煙的COPD。VEGFA作為一種細(xì)胞生長因子，由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，通過特異性與血管上皮結(jié)合促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)血管生成、增加微血管通透性[12]。VEGFA在肺組織，尤其是肺泡上皮中表達(dá)豐富，參與肺泡發(fā)育和成熟，可通過促進(jìn)前列環(huán)素產(chǎn)生、增加超氧化物歧化酶表達(dá)等維持肺管正常結(jié)構(gòu)和生理功能，并對肺損傷起修復(fù)作用[13]。現(xiàn)有報道顯示，VEGFA 基因rs9296092 位點多態(tài)性與COPD易感有關(guān)[14]。Periostin 是一種具有多結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，可結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)蛋白以及催化I 型膠原交聯(lián)的BMP-1在細(xì)胞黏附中發(fā)揮作用，Periostin可增強(qiáng)結(jié)締組織機(jī)械強(qiáng)度和分子間緊密關(guān)系，維持細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)[15]。Periostin 作為白介素-13 下游分子，參與哮喘變態(tài)反應(yīng)、氣道高反應(yīng)和重塑過程[16]。Periostin 水平與COPD 氣道嗜酸性炎癥反應(yīng)相關(guān)，與皮質(zhì)類固醇聯(lián)合支氣管擴(kuò)張劑治療反應(yīng)也存在密切關(guān)系[17]。Periostin 通過自分泌的方式調(diào)節(jié)金屬蛋白酶及成纖維細(xì)胞生長因子-β，上調(diào)成纖維細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞中膠原蛋白表達(dá)，促進(jìn)氣道纖維化，加重氣道損傷[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，NGAL、VEGFA 有助于鑒別ACOS 和哮喘，而Periostin 更有助于鑒別ACOS 和COPD。ACOS 組血清NGAL 水平升高可能與吸煙、反復(fù)氣道感染、中性粒細(xì)胞浸潤性炎癥刺激促使NGAL 分泌有關(guān)。VEGFA 水平升高原因為COPD 慢性低氧血癥促進(jìn)參與氧運輸?shù)鞍妆磉_(dá)，繼而促進(jìn)血管生成相關(guān)細(xì)胞因子及其受體表達(dá)，促使新生血管生成[19]。Periostin 水平上升可能與氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥刺激有關(guān)。ACOS 組血清NGAL、VEGFA、Periostin 水平較哮喘組和COPD 組高的原因為哮喘患者氣道炎癥以嗜酸性粒細(xì)胞為主，COPD 則以中性粒細(xì)胞為主，ACOS 則兼有嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤，兩種炎性細(xì)胞作用下導(dǎo)致NGAL 分泌增多。Wang 等[20]發(fā)現(xiàn)ACOS 患者血清NGAL 水平升高，是鑒別ACOS 和哮喘的潛在生物學(xué)指標(biāo)。Ding 等[21]報道也指出VEGFA 鑒別診斷ACOS具有較高的特異性。

本研究發(fā)現(xiàn)，ACOS組存在明顯的肺功能下降，較哮喘組嚴(yán)重，與COPD 組類似。張瓚等[22]報道也顯示ACOS 具有和COPD 類似的臨床特征和肺功能。Wang 等[20]認(rèn)為ACOS 患者存在中度的氣流阻塞、支氣管擴(kuò)張反應(yīng)和肺氣腫，NGAL水平與肺氣腫程度呈正相關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，NGAL、VEGFA、Periostin 水平與FEV1/FVC、FEV1%pred呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明NGAL、VEGFA、Periostin 與ACOS 患者肺功能存在密切關(guān)系，提示NGAL、VEGFA、Periostin 過度合成和分泌可能加重氣道和肺組織酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤，加重氣道和肺組織損傷，引起肺功能降低。Gao 等[22]也發(fā)現(xiàn)痰液NGAL水平與ACOS患者FEV1/FVC獨立相關(guān)。

ROC 證實NGAL、VEGFA、Periostin 在鑒別診斷ACOS 方面均具有一定價值，但是均存在靈敏度偏低的局限，分析原因為NGAL、VEGFA 合成在ACOS 組、COPD 組均增多，Periostin 分泌在哮喘組和ACOS 組均增加，單獨使用NGAL、VEGFA、Periostin可能無法有效鑒別ACOS、COPD和哮喘，而聯(lián)合NGAL、VEGFA、Periostin 三項指標(biāo)檢測診斷ACOS 的AUC 達(dá)0.912，說明聯(lián)合診斷可大大提高診斷準(zhǔn)確率，提示NGAL、VEGFA、Periostin 均升高患者存在哮喘和COPD 共病的可能性較大，對于診斷ACOS具有較大臨床價值。

綜上所述，ACOS 患者血清NGAL、VEGFA、Periostin 水平均明顯升高，高水平NGAL、VEGFA、Periostin 水與ACOS 發(fā)病和肺功能降低密切相關(guān)。NGAL、VEGFA、Periostin有望成為對COPD患者并發(fā)ACOS進(jìn)行診斷的潛在生物學(xué)指標(biāo)。