miR-138、miR-149表達與非肌層浸潤性膀胱癌患者臨床病理特征及預后的關系*

才 讓，王永芹，祁蕙燕，張 輝，趙 瑩

（青海省西寧市第一人民醫院檢驗科，西寧 810000）

膀胱癌是目前我國最為常見的泌尿系統腫瘤，其中有將近75%的膀胱癌為非肌層浸潤性膀胱癌（NMIBC）[1]。NMIBC復發較為普遍且難以預測，因此尋找能夠預測NMIBC患者復發的潛在生物標志物尤為重要[2-3]。微小RNA（microRNA，miR）是一類由內源基因編碼的長度為19～24 個核苷酸的非編碼RNA，其在真核生物中普遍存在[4]。研究表明，某些miR在癌組織及其癌旁組織中的表達水平不同，其對于癌癥的預測及預后判斷具有很大的應用價值[5-6]。其中miR-138在許多癌癥的發生和發展過程中發揮重要的作用。有研究報道，miR-138 在前列腺癌組織中的表達顯著下調，主要通過調節叉頭框蛋白（forkhead box protein 1，FOXC1）表達抑制癌細胞增殖[7]；miR-138 在頭頸鱗狀細胞癌中異常表達，可抑制癌細胞侵襲，促進癌細胞凋亡[8]。此外，miR-149 在許多癌組織中呈低表達，在調節人類癌細胞增殖、凋亡、轉移等過程中起著重要作用[9]。有研究表明，miR-149可能對于NMIBC、結直腸癌、宮頸癌等均起到抑制作用[10-12]；miR-149 通過調節Ras 相關蛋白1抑制成神經細胞瘤細胞增殖[13]。本研究通過檢測miR-138和miR-149在NMIBC組織中的表達，分析兩者與NMIBC患者臨床病理參數和預后的關系，為NMIBC早期診斷和預后判斷提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 收集2013 年1 月至2015 年2 月在青海省西寧市第一人民醫院行手術治療的49 例NMIBC患者的癌組織及其癌旁組織。NMIBC患者中男40例，女9例；年齡38～87歲，中位年齡67歲；TNM分期：Ta期32例，T1期17例；腫瘤直徑＜3 cm 25 例，≥3 cm 24 例；有遠處轉移29 例，無遠處轉移20例；淋巴結轉移患者27例，無淋巴結轉移患者22例。本研究已取得醫院倫理委員會批準。

1.2 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測組織中miR-138和miR-149表達 用Trizol提取RNA，逆轉錄為cDNA，ABI 7500 型熒光定量PCR 儀進行PCR擴增，PCR 條件：95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，共41 個循環，總體系為20 μL。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列如下：miR-138正向引物：5’-GCTGGTGTTGTGAATCAG-3’，反向引物：5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’；miR-149正向引物：5’-TCTGGCTCCGTGTCTTC-3’，反向引物：5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’；U6 正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。采用2-DDCT法計算目的基因相對表達量。

1.3 隨訪 定期對患者進行隨訪，隨訪方式為膀胱鏡復查，時間為患者被確診后的5年內，每3個月復查一次，直至患者死亡或最后隨訪時間。統計患者術后生存時間和5年生存率。

1.4 統計學方法 采用SPSS 24.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗；采用Kaplan-Meier 分析術后生存情況，生存率比較采用Log-rank 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-138 和miR-149的表達NMIBC患者癌組織miR-138、miR-149 相對表達量分別為0.31±0.11、0.51±0.08，低于癌旁組織的1.04±0.07、1.03±0.09（t=12.991、30.229，均P＜0.001）。

2.2 miR-138、miR-149 表達與患者臨床病理參數的關系 miR-138和miR-149的表達水平在有淋巴結轉移和遠處轉移的NMIBC患者中明顯降低（P＜0.05），而在不同性別、腫瘤等級、TNM分期、腫瘤直徑的患者中的表達無明顯差異（P＞0.05），見表1。

表1 miR-138、miR-149表達與患者臨床病理參數的關系

2.3 miR-138與miR-149表達與患者預后的關系 以miR-138中位數為分界線，將NMIBC患者分為高表達組和低表達組，中位數為0.22，高表達組24例、低表達組25例。高表達組和低表達組的5年生存率分別為87.50%（21/24）和68.00%（17/25），術后生存時間分別為（59.08±1.60）個月和（51.28±2.80）個月（Log-Rank χ2=11.231，P=0.001），見圖1A。以miR-149中位數為分界線，將NMIBC患者分為高表達組和低表達組，中位數為0.50，高表達組24例、低表達組25 例。高表達組和低表達組的5 年生存率分別為83.33%（20/24）和60.00%（15/25），術后生存時間分別為（56.96±1.87）個月和（50.56±2.64）個月（Log-Rank χ2=7.203，P=0.010），見圖1B。

圖1 miR-138與miR-149表達與患者預后的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，是一種對患者的生命產生威脅的疾病。膀胱癌可分為NMIBC和肌層浸潤性膀胱癌，目前NMIBC的治療方式主要是經尿道膀胱腫瘤電切術和術后膀胱內灌注化療，但是在治療后一部分患者會出現復發的情況[1-3]，而復發對患者生存預后有極大影響。miR是一類非常重要的機體調控因子，成熟的miRNA 可以標靶mRNA 的3’端非編譯區或者編譯區，從而沉默標靶基因，并且在諸多病理生理過程中發揮著重要的生物調節作用[14-15]。研究表明，miR在肺癌、前列腺癌和乳腺癌等惡性腫瘤中存在異常表達，其表達與患者的病理特征有關[16-18]。miR-138作為腫瘤抑制因子，可通過靶向鋅指E 盒結合的同源盒蛋白2（zinc finger e-box binding homeobox 2，ZEB2）抑制膀胱癌細胞癌細胞轉移[19]；同時，膀胱癌中miR-138 表現為異常下調，與頭頸癌和甲狀腺癌中的觀察結果一致，其中miR-138 的下調與端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)的表達增強有關[20]。此外，最近有研究發現，miR-138可能在非小細胞肺癌順鉑耐藥的發展中發揮重要作用，是肌肉浸潤性膀胱癌中常用的關鍵藥物[21]。

本研究結果表明，NMIBC組織中miR-138相對表達量明顯低于癌旁組織，表明miR-138 有可能作為抑制性的miR 發揮作用，參與NMIBC 的發生和發展。這與Yang 等[20]發現在膀胱癌中miR-138 異常下調相一致。此外，miR-138 的表達水平與NMIBC腫瘤轉移和淋巴結轉移的惡性特征相關聯，發生腫瘤高轉移和明顯淋巴結轉移的NMIBC患者癌組織中miR-138 的表達水平降低。同時，本研究對NMIBC 患者生存預后情況進行分析顯示，NMIBC 患者中miR-138 表現為高表達時患者具有較長的術后生存時間和較高的術后生存率。表明組織中miR-138 的表達水平能夠體現NMIBC 患者的腫瘤治療情況，提示其可能成為NMIBC 患者預后預測的輔助指標。

本研究結果還顯示，miR-149在NMIBC組織中的表達明顯低于癌旁組織，且與患者淋巴結轉移及腫瘤發生遠處轉移存在一定關聯，miR-149 表達水平在發生淋巴結轉移和腫瘤發生遠處轉移的NMIBC 患者中明顯降低，這說明miR-149 在NMIBC 組織樣本中表達下調時，NMIBC 患者出現明顯的淋巴結轉移現象，同時腫瘤較容易發生遠端轉移。miR-149 在許多癌癥中表現為低表達，在癌癥細胞的調節和腫瘤發生過程中發揮著重要作用[9]。有研究表明，miR-149-5p可以通過靶向Fas配體(FASLG)抑制急性髓系白血病細胞系THP-1的凋亡，進而通過死亡結構域(p-FADD)和caspase-2、caspase-3 和caspase-8 的啟動對Fas 相關磷酸化形式產生負面影響[22]；另外有文獻報道，miR-149-5p的表達水平與多配體蛋白聚糖-1（syndecan-1，SDC-1)有關，SDC-1 是前列腺癌中沉默的4 種哺乳動物肝素硫酸酯蛋白多糖之一[23]，SDC-1 的增加有利于細胞的存活[24]。同時，本研究結果表明，miR-149 在NMIBC發生和發展過程中發揮抑癌功能，預后結果顯示，NMIBC 患者中miR-149 出現高表達時，NMIBC患者具有更長的預后生存時間，表明其可以作為潛在的NMIBC預后判斷的生物標志物。

綜上所述，miR-138 和miR-149 在NMIBC 的發生和發展過程中均表現為異常的低表達。二者高表達在NMIBC的腫瘤的發生和發展過程中發揮抑制功能，可以抑制NMIBC 的惡性進展，同時，二者低表達水平與NMIBC 患者的不良生存預后相關，表明二者可作為NMIBC的潛在生物標志物和潛在治療靶點。