褪黑素對蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠模型早期腦損傷的影響及機制研究

楊松，李軍鵬，王彥茗，馬廉亭

據(jù)統(tǒng)計，蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）發(fā)病30 d內(nèi)死亡率高達50%，且50%以上的幸存者伴有不可逆的神經(jīng)功能損傷，給患者家庭及社會帶來沉重的負擔［1］。SAH的主要發(fā)病原因是顱內(nèi)動脈瘤破裂和顱內(nèi)血管畸形，且以顱內(nèi)動脈瘤破裂多見。近年隨著手術技術的提高，越來越多的SAH患者能夠得到較好的治療，但術后仍有部分患者出現(xiàn)情感和認知障礙［2］。研究表明，SAH后遲發(fā)性腦血管痙攣是患者死亡的主要原因之一，但減輕遲發(fā)性腦血管痙攣又不能改善患者預后［3］。近年有學者提出了早期腦損傷（early brain injury，EBI）的概念并認為其是SAH患者致死、致殘的主要原因之一［4］。因此，研究SAH后EBI的發(fā)生機制、尋找藥物靶點可能為SAH患者提供新的治療思路。本實驗通過構建SAH小鼠模型并給予褪黑素（melatonin，MT）干預后發(fā)現(xiàn)，MT能有效減輕SAH后EBI，其機制可能與MT保護神經(jīng)元、抑制神經(jīng)元凋亡有關，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗時間為2019年9月至2020年6月。選取健康成年C57BL/6J雄性小鼠54只，體質(zhì)量22～25 g，飼養(yǎng)于SPF級實驗動物屏障環(huán)境中，溫度（25 ℃）、濕度（65%）恒定，12 h光照/黑暗交替進行；并給予小鼠充足的滅菌飲用水、專用飼養(yǎng)飼料。所有小鼠適應性飼養(yǎng)3 d后，隨機分為假手術組（Sham組）、SAH組、SAH+MT組，每組18只。所有實驗操作經(jīng)過中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物倫理委員會批準，且嚴格遵守相關操作規(guī)范和規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器 本實驗過程中的主要試劑及儀器見表1～2。

表1 主要試劑Table 1 Main reagents

表2 主要儀器Table 2 Main instruments

1.3 實驗方法 所有小鼠造模前禁食12 h，禁水6 h。SAH組和SAH+MT組小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后仰臥位固定于手術板上，仔細分離頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA）和頸外動脈（exernal carotid artery，ECA），結扎ECA近心端及遠心端，中間剪斷，并在ICA和ECA分叉處的ECA起始部置線，然后將ICA、CCA采用動脈夾夾閉，將線栓由ECA插入，打開ICA處動脈夾，將線栓插入ICA；將進入ICA的銳化尼龍線繼續(xù)插入至翼腭動脈起始部時，輕抬ECA使此處的彎曲消失，以利于尼龍線順利通過。向遠端繼續(xù)插入尼龍線至ICA顱內(nèi)段，有阻力感后再插入2 mm左右，刺破willis環(huán)，造成SAH后迅速將尼龍線拔出，縫合創(chuàng)口［5］。Sham組小鼠除不刺破willis環(huán)外，其他手術操作同SAH組和SAH+MT組。待小鼠復蘇后放回鼠籠。SAH+MT組小鼠分別于造模后2 h及12 h腹腔注射MT 150 mg/kg［6］，SAH組小鼠分別于造模后2 h及12 h腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。造模后24 h，各組分別選取6只小鼠進行Garcia評分，之后處死并取腦組織測定含水量，選取6只小鼠用于尼氏染色實驗及TUNEL染色，選取6只小鼠用于提取蛋白組織并進行Western Blot。

1.4 建模成功的標準 建模后24 h取小鼠腦組織評估SAH嚴重程度，具體如下：將基底包括腦干分為6個節(jié)段，每個節(jié)段分為0～3級，對應評為0～3分：0級為無SAH；1級為輕度SAH；2級為中度SAH伴可辨認動脈；3級為SAH覆蓋腦動脈。6個節(jié)段得分之和≥8分為造模成功，剔除造模不成功小鼠并重新補充小鼠進行建模。

1.5 觀察指標

1.5.1 神經(jīng)功能缺損程度 參考Garcia評分系統(tǒng)評估三組小鼠神經(jīng)功能缺損程度［7］，包括前肢伸展（0～3分）、自發(fā)活動（0～3分）、攀爬（1～3分）、四肢運動的對稱性（0～3分）、對觸痛的反應（1～3分）和本體感覺（1～3分）6項內(nèi)容，Garcia評分越高表明神經(jīng)功能缺損越嚴重。Garcia評分均是在對研究者和數(shù)據(jù)測量者施盲的情況下進行的。

1.5.2 腦含水量 采用標準濕法測定三組小鼠腦含水量，具體如下：建模后24 h，采用1%的戊巴比妥鈉深度麻醉小鼠，立刻斷頭取腦組織，分離右腦、左腦、大腦半球和腦干，并盡快采用電子分析天平稱取其濕重；大腦切片后在105 ℃下干燥24 h，盡快采用電子分析天平稱取其干重，并計算腦含水量，腦含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.5.3 大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目 采用尼氏染色實驗觀察大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元情況，具體如下：取全腦組織制成石蠟切片，脫蠟至水，切片置于60 ℃溫箱，采用0.5%甲苯胺藍染色40 min；95%乙醇鏡下控制分色，脫水封固；在高倍鏡下（×400）觀察小鼠右側顳葉皮質(zhì)切片連續(xù)5個相鄰視野，并記錄存活神經(jīng)元數(shù)目。

1.5.4 神經(jīng)元凋亡率 采用TUNEL染色檢測神經(jīng)元凋亡情況，主要步驟如下：腦組織切片先在50 μl TUNEL反應緩沖液中孵化1 h，期間保持37 ℃和黑暗濕潤的環(huán)境。然后，切片采用DAPI孵育5 min，以染出所有細胞核，采用封固液封固，調(diào)整熒光顯微鏡激發(fā)波長范圍為450～500 nm，發(fā)射波長范圍為515～565 nm，觀察視野并拍照（綠色熒光）。最后，采用流式細胞儀測定TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)目。神經(jīng)元凋亡率=TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)目/總神經(jīng)元數(shù)目×100%。

1.5.5 凋亡相關蛋白相對表達量 采用Western Blot檢測Bax蛋白、B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白、Caspase-3蛋白相對表達量，主要步驟如下：配制裂解液，研磨組織，裂解提取小鼠右側顳葉皮質(zhì)總蛋白；配制SDS-PAGE凝膠，蛋白樣品變性處理，上樣，電泳，轉膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育，蛋白顯影，重復3次取平均值。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 神經(jīng)功能缺損程度和腦含水量 三組小鼠Garcia評分及右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量比較，差異有統(tǒng)計學意義（F值分別為56.35、60.36、47.87、30.17、26.34，P值均＜ 0.001）；SAH組和SAH+MT組小鼠Garcia評分低于Sham組，右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量高于Sham組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SAH+MT組小鼠Garcia評分高于SAH組，右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量低于SAH組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 三組小鼠Garcia評分及右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量比較Figure 1 Comparison of Garcia score and water content of right brain，left brain，cerebral hemisphere and brain stem among the three groups

2.2 大腦皮質(zhì)神經(jīng)元情況 三組小鼠大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=26.14，P＜0.01）；SAH組和SAH+MT組大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目少于Sham組，SAH+MT組大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目多于SAH組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。Sham組小鼠大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目最多且狀態(tài)最好，神經(jīng)元胞體與尼氏小體清晰可見；SAH組小鼠大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元排列松散且出現(xiàn)染色質(zhì)凝集；SAH+MT組小鼠存活神經(jīng)元狀態(tài)較SAH組明顯改善，尼氏小體數(shù)量較SAH組有所增加，見圖3。三組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=60.42，P＜0.01）；SAH組和SAH+MT組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率高于Sham組，SAH+MT組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率低于SAH組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4～5。2.3 凋亡相關蛋白相對表達量 三組小鼠Bax蛋白、Bcl-2蛋白、Caspase-3蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（F值分別為42.17、85.25、54.19，P值均＜0.01）；SAH組與SAH+MT組小鼠Bax蛋白、Caspase-3蛋白相對表達量高于Sham組，Bcl-2蛋白相對表達量低于Sham組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SAH+MT組小鼠Bax蛋白、Caspase-3蛋白相對表達量低于SAH組，Bcl-2蛋白相對表達量高于SAH組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖6。

圖2 三組小鼠大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目比較Figure 2 Comparison of number of surviving neuron of cerebral cortex among the three groups

圖3 三組小鼠腦組織尼氏染色結果（×400）Figure 3 Nissl staining results of brain tissue in three groups of mice

圖4 三組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)Figure 4 Morphology of cerebral cortex of the three groups

圖5 三組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率比較Figure 5 Comparison of neuronal apoptosis rate of cerebral cortex among the three groups

圖6 三組小鼠凋亡相關蛋白相對表達量比較Figure 6 Comparison of relative expression levels of apoptosis related proteins among the three groups

3 討論

腦血管痙攣指顱內(nèi)動脈的持續(xù)性收縮狀態(tài)，其是SAH的并發(fā)癥之一，且被認為是SAH后的主要致死原因之一，但減輕遲發(fā)性腦血管痙攣又不能改善患者預后［2］。既往研究表明，SAH患者出血后30 d內(nèi)死亡者占50%，且死亡病例中60%～70%是在SAH后48 h內(nèi)死亡，但遲發(fā)性血管痙攣常于SAH后1～2周出現(xiàn)［8］，這說明遲發(fā)性腦血管痙攣并非是SAH后的主要致死原因。近年研究認為，SAH后EBI可能是導致患者致殘、致死的主要原因，而神經(jīng)元凋亡又是SAH后EBI的主要病理過程之一［9］。神經(jīng)元凋亡可分為誘導啟動階段、細胞內(nèi)調(diào)控階段、實施階段和吞噬搬運4個階段［10］，對凋亡進程有重要作用的凋亡相關蛋白包括Caspase蛋白家族、IAP蛋白家族、Bcl-2蛋白家族及P53蛋白等，其中Bcl-2蛋白家族的主要功能是調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，家族成員通過形成同源（Bcl-2/Bcl-2，Bax/Bax）或異源（Bcl-2/Bax）二聚體而影響細胞色素c的釋放，最終Bcl-2同源二聚體可抑制細胞凋亡，Bax異源二聚體可促進細胞凋亡，但無論哪一條凋亡信號途徑均需要通過激活Caspase蛋白家族實現(xiàn)。

MT又名抑黑素，最早是于牛松果體內(nèi)提取出來的，因其可以使皮膚的黑色素凝集從而變白而得名，其主要由松果體分泌，人視網(wǎng)膜也能分泌少量的MT［11］。MT在心臟和腎臟等多種器官的缺血和再灌注損傷中均具有重要的保護作用，臨床研究表明，術前以預防為目的地注射MT能夠明顯改善患者心臟功能，減輕氧化損傷和心肌細胞凋亡［12］。

林達等［13］研究表明，MT可以減輕SAH后細胞凋亡，從而減輕SAH后EBI。毛崇丹等［14］進行的動物實驗表明，MT可以抑制NLRP3炎性小體，從而減輕小鼠SAH后EBI。也有研究表明，MT可以通過抗炎、抗氧化機制而減輕SAH后腦損傷［15］。本研究結果顯示，SAH組和SAH+MT組小鼠Garcia評分低于Sham組，右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量及大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率高于Sham組，大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目少于Sham組；SAH+MT組小鼠Garcia評分高于SAH組，右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量及大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率低于SAH組，大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目多于SAH組，提示SAH小鼠存在神經(jīng)功能缺損、腦水腫及神經(jīng)元凋亡增加等情況，而MT能有效減輕神經(jīng)功能缺損、腦水腫并抑制神經(jīng)元凋亡。本研究結果還顯示，SAH組與SAH+MT組小鼠Bax蛋白、Caspase-3蛋白相對表達量高于Sham組，Bcl-2蛋白相對表達量低于Sham組（P＜0.05）；SAH+MT組小鼠Bax蛋白、Caspase-3蛋白相對表達量低于SAH組，Bcl-2蛋白相對表達量高于SAH組，提示SAH小鼠Bax蛋白表達上調(diào)、Bcl-2蛋白表達下調(diào)，Bax/Bcl-2比例升高，裂解性Caspase-3明顯升高，細胞更傾向于發(fā)生凋亡；而MT能夠下調(diào)Bax蛋白，上調(diào)Bcl-2蛋白水平，降低Bax/Bcl-2比例，抑制Caspase-3蛋白活化，從而抑制SAH后神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，SAH小鼠存在神經(jīng)功能缺損、腦水腫及神經(jīng)元凋亡增加等情況，而MT可以通過下調(diào)Bax蛋白表達、上調(diào)Bcl-2蛋白表達、抑制Caspase-3蛋白活化而阻斷神經(jīng)元凋亡過程，進而減輕SAH后EBI；但MT的具體作用通路及靶點還不明確，仍需后期進一步研究。

作者貢獻：楊松進行文章的構思與設計，負責撰寫、修訂論文；李軍鵬進行研究的實施與可行性分析，數(shù)據(jù)收集、整理、分析；王彥茗進行結果分析與解釋；馬廉亭負責文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。