卵巢子宮內膜樣癌免疫相關基因的生物信息學分析

陳聰 倪樂宜 陳育梅

卵巢子宮內膜樣癌是來源于子宮內膜和卵巢表面上皮的卵巢上皮性惡性腫瘤，占卵巢上皮性腫瘤的10%[1]。子宮內膜異位癥和上皮性卵巢癌之間的相關性一直有所報道，有學者認為子宮內膜異位癥可能是上皮性卵巢癌的癌前病變[2]；子宮內膜異位癥患者的卵巢癌風險增加[3]。子宮內膜異位癥是一種與免疫及炎癥反應相關的慢性疾病，發生機制與多因素相關，其中涉及到癌基因的激活和抑癌基因的失活等[4]。近年來生物信息學分析方法為腫瘤發生機制、早期診斷、預后生物標志物和治療靶標等研究提供了思路[5]。本研究通過高通量基因表達（gene expression databases，GEO）數據庫識別由正常子宮內膜向卵巢子宮內膜樣癌發展潛在的免疫相關生物標志物，進行生物學功能和信號通路分析，探討其相互作用網絡，以期為卵巢子宮內膜樣癌的發病機制、早期診斷和預后提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 芯片數據 從GEO數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）搜索關鍵詞“卵巢子宮內膜樣癌”，樣本滿足以下條件：（1）使用從人體組織獲得的樣本；（2）芯片同時包含健康樣本和卵巢子宮內膜樣癌腫瘤組織；（3）樣本總數≥10，且數據處理合格。獲得滿足條件的GSE57545芯片數據微陣列數據集，GSE57545數據集中包含29份正常子宮內膜樣本和18份卵巢子宮內膜樣癌樣本。

1.3 差異表達基因生物信息學分析 本研究使用DAVID6.8在線數據分析平臺（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）[6]對差異表達基因進行基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析提高結果的可靠性，GO分析（http：//geneontology.org）包括分子功能、生物學過程和細胞組成3個部分，KEGG（http：//www.kegg.jp）是一個存儲基因組、疾病、生物化學信息等大量數據的數據庫，用來研究與差異表達基因相關的潛在信號通路，當P＜0.05和節點數≥10認為具有統計學意義，表明基因呈顯著富集。

1.4 蛋白互作（protein-protein interaction networks，PPI）網絡構建 為研究差異表達基因之間關鍵通路的相互作用，利用STRING在線分析工具（https://string-db.org/）構建PPI網絡，使用Cytoscape3.7.2軟件計算連接度最高的10個基因作為關鍵基因。

1.5 差異表達基因富集途徑分析 pathview（https://pathview.uncc.edu/analysis）可以將信號通路可視化，可基于KEGG富集分析結果將基因的表達、調控和相關功能帶入路徑中。

1.6 關鍵基因的生存分析 Kaplan-Meier繪圖儀（http://kmplot.com/analysis/）生物信息分析平臺中共含有1 435例卵巢癌患者的數據，隨訪時間為250個月，可基于對本研究篩選出的10個關鍵基因進行在線生存分析檢驗生物標志物，并計算出95%CI和P值，評估卵巢子宮內膜樣癌的免疫相關關鍵基因的預后價值。

2 結果

表1 卵巢子宮內膜樣癌差異表達基因

2.2 差異表達基因的GO分析和KEGG富集分析結果 對差異表達基因進行GO分析（表2）和KEGG富集分析（表3），GO分析表明，差異表達基因主要富集在“免疫反應”“IFN-γ介導的信號通路”“炎癥反應”“信號轉導”“先天免疫反應”“細胞黏附”“RNA聚合酶Ⅱ啟動子對轉錄的正向調控”的生物學過程中，細胞成分主要富集在“質膜外側面”“質膜”“細胞外基質”“細胞表面”“膜”“原生質膜的組成成分”“細胞外泌體”“膜的整體成分”“細胞外區域”，分子功能主要富集在“受體結合”和“蛋白質結合”。KEGG富集分析表明差異基因主要在“結核病”“金黃色葡萄球菌感染”“吞噬體”“抗原處理和呈遞”“Toll樣受體信號通路”“細胞黏附分子”等信號通路富集。這些差異表達基因的富集途徑表明它們主要參與機體的免疫與炎癥反應。

表2 差異表達基因的G O富集分析

表3 差異表達基因的K EGG富集分析

2.3 差異表達基因的PPI分析結果 將篩選出的差異表達基因提交到STRING數據庫，構建出具有84個節點和599條邊的PPI網絡（圖1），并用Cytoscape進行可視化，基于該網絡應用CytoHubba插件從PPI網絡中篩選出連接度最高的10個關鍵基因，分別是細胞黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1）、Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）、C-X-C趨化因子配體8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、C-X-C基序趨化因子配體10（C-XC motif chemokine ligand 10，CXCL10）、IL-18、C-X-C基序趨化因子配體1（C-X-C motif ligand 1，CXCL1）、C-X-C基序趨化因子配體2（C-X-C motif chemokine ligand 2，CXCL2）、C-X-C基序趨化因子配體12（C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12）、前列腺素-內過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）（表4），根據關鍵基因確定差異表達基因之間的相互作用模式。

表4 10個連接度最高的關鍵基因蛋白互作網絡中心節點分數

圖1 差異表達基因的蛋白互作（PP I）網絡圖

2.4 富集途徑中重疊差異表達基因的調控 使用pathview繪制富集途徑，展現差異表達基因發揮的作用，“吞噬體”信號通路中TLR2等許多上調基因誘導了Toll樣受體基因的活化（圖2，見插頁），從而激活“Toll樣受體信號通路”中PI3K-Akt信號通路，引起免疫基因的高表達，CXCL12編碼免疫調節和參與炎癥過程有關的分泌蛋白IL-12，產生促炎癥反應效應（圖3，見插頁）。“抗原處理和呈遞”信號通路中免疫物質主要組織相容性復合體Ⅱ的高表達誘導產生細胞因子激活免疫細胞，通過T細胞受體信號通路活化CD4+T細胞（圖4，見插頁）。通過確定差異表達基因的全面途徑和網絡分析展示了導致炎癥和免疫應答發生的路徑。

2.5 10個關鍵基因的生存分析結果 為了確定10個關鍵基因的預后價值，使用Kaplan-Meier繪圖儀生物信息分析平臺評估1 435例卵巢癌患者的總生存時間和無復發生存時間，發現TLR2、CXCL10、CXCL12、IL-18的高表達與子宮內膜異位癥相關性卵巢子宮內膜樣癌患者預后不良相關，CXCL8、GAPDH、CXCL1的高表達是卵巢癌患者良好預后的相關因素，ICAM1、CXCL2、PTGS2于總體生存分析無統計學差異。

3 討論

雖然有很多研究認為卵巢子宮內膜樣癌與子宮內膜異位癥相關，但其具體的分子機制仍需進一步研究。近年來隨著基因組測序、高通量測序等技術的不斷改進，生物信息學分析方法被廣泛應用于對芯片數據集的分析。故探索卵巢子宮內膜樣癌的潛在關鍵免疫基因和生物標志物為了解其發病機制，做到早期診斷和預后判斷提供了有效的方法[7]。本研究通過對GSE57545數據集中18個卵巢子宮內膜樣癌組織樣本和29個正常子宮內膜組織樣本分析，共篩選出了87個差異表達基因，其中54個上調基因和33個下調基因。通過GO富集分析顯示免疫相關差異表達基因主要參與“免疫反應”“IFN-γ介導的信號通路”“炎癥反應”“信號轉導”“先天免疫反應”“細胞黏附”“RNA聚合酶Ⅱ啟動子對轉錄的正向調控”等生物學過程，有研究表明免疫功能紊亂、細胞-基質黏附的變化可促進細胞的變異以及腫瘤微環境的形成[8]，這可能與卵巢子宮內膜樣癌的發生、發展密切相關。KEGG信號通路富集分析中差異表達基因主要涉及“吞噬體”“抗原處理和呈遞”“Toll樣受體信號通路”“細胞黏附分子”等信號通路，其中“Toll樣受體信號通路”在多種癌癥中起關鍵作用[9]，“細胞黏附分子”信號通路在細胞的黏附、侵襲、轉移、增生等過程中也發揮重要作用[10]。10個關鍵基因（ICAM1、TLR2、CXCL8、GAPDH、CXCL10、IL-18、CXCL1、CXCL2、CXCL12、PTGS2）在信號通路圖中顯示多條通路中多種細胞因子的異常表達可導致CD4+T細胞的激活。本研究主要涉及到TLR2和CXCL12免疫基因的異常表達，其中PI3K-Akt信號通路的激活引起卵巢癌的發生已在多項研究得到驗證[11]。生存分析表明TLR2、CXCL10、CXCL12、IL-18的高表達和CXCL8、GAPDH、CXCL1的低表達可能是判斷卵巢子宮內膜樣癌預后的免疫相關生物標志物。

TLR2編碼的蛋白質是Toll樣受體家族的成員，研究表明TLR的激活會導致Toll樣受體信號通路上調從而調節宿主的炎癥反應[12]；誘導TLR2的耐受可抑制自身免疫炎癥[13]。也有文獻報道指出上調TLR2的信號轉導可能激活炎癥過程的非經典途徑并減弱腫瘤的免疫抑制作用，同時與IL-12結合可刺激產生與卵巢癌相關的CD4+和CD8+效應T細胞[14]，與本研究信號通路中所涉及的關鍵基因相一致，因此推斷TLR2的過表達形成腫瘤微環境的免疫抑制，促進了卵巢子宮內膜樣癌的發生、發展。CXCL12編碼間分泌家族的基質細胞衍生的α趨化因子成員，CXCL12及其受體的相互作用可激活下游信號傳導途徑，影響腫瘤血管生成，促進腫瘤細胞增殖，在免疫監視、炎癥反應、組織穩態以及腫瘤生長和轉移等許多不同的細胞功能中發揮作用[15]，有文獻報道CXCL12通過與其特異性受體CXCR4相互作用來介導炎癥因子的作用，在子宮內膜異位癥模型中CXCR4-CXCL12軸的激活會增加癌細胞的增殖、遷移和侵襲[16]，由此推測CXCL12的高表達與卵巢子宮內膜樣癌的發生、發展密切相關，為其治療提供了新的方向。

綜上所述，慢性炎癥是腫瘤發生的重要影響因素之一，本研究所選用的數據集中在細胞外基質和細胞膜上異常表達的炎癥、免疫相關基因，這些基因表達可能增加全身性炎癥反應，細胞通過富集、黏附形成逃逸免疫的腫瘤微環境從而影響卵巢子宮內膜樣癌發生、發展過程。本研究通過生物信息學方法篩選了87個差異表達基因并初步探索了與卵巢子宮內膜樣癌發生、發展相關的生物標志物和信號通路；結果發現差異表達基因主要富集在“吞噬體”“抗原處理和呈遞”“Toll樣受體信號通路”“細胞黏附分子”等信號通路來調控卵巢子宮內膜樣癌的發生、發展。盡管已經鑒定出幾個關鍵基因可作為卵巢子宮內膜樣癌判斷發病機制、早期診斷和預后的生物標志物，但本研究仍有以下局限性，首先這是一項生物信息學分析研究，缺乏實驗和臨床驗證；其次，無法消除不同組織學類型對結果的影響，不同樣本之間的測量也可能存在差異。