第二代測序技術用于全膝關節置換術后假體周圍感染診斷的臨床價值

董伊隆 錢約男 李一民 劉良樂 蔡春元

假體周圍感染（periprosthetic jiont infection，PJI）是人工關節置換術后的嚴重并發癥。PJI的正確診斷和病原體的確定是關節翻修手術的關鍵。而在臨床上，往往關節液常規細菌培養陰性。一些研究表明細菌培養陰性PJI的發病率達50%[1-2]。臨床醫生不知道感染的病原體，就無法有效地監測患者對治療的反應，并確定感染是否得到控制。因此，許多學者正致力于探索并評估一些新的PJI診斷指標，以解決這一難題。

第二代測序技術（next-generation sequencing，NGS）是一種新的DNA/RNA測序方法[3]。NGS由于其成本低和檢測快速被應用于醫學微生物學，可以有效提高識別病原體的效率[3-4]。然而，NGS用于PJI患者的檢測鮮有報道，因此筆者對NGS用于PJI患者關節液中病原體的檢測進行了研究，并與常規細菌培養結果進行比較分析，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2017年1月1日至2019年12月1日溫州醫科大學附屬第三醫院就診的全膝關節置換術（total knee arthroplasty，TKA）后臨床懷疑為PJI的15例患者，其中男6例，女9例；年齡57～81歲，平均66.5歲；置換術前均診斷為膝關節骨性關節炎。15例患者均行膝關節穿刺關節液細菌培養和NGS檢測。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準：（1）初次TKA后；（2）TKA后出現體溫升高、膝關節皮溫升高，膝關節出現腫脹、積液、靜息痛、竇道或假體松動等癥狀和體征[5]，臨床懷疑PJI；（3）送檢關節液標本符合NGS檢測細菌培養的要求。排除標準：（1）腫瘤、自身免疫性疾病等非感染性疾病患者；（2）送檢標本量不能滿足NGS檢測要求，或已被細菌污染；（3）拒絕簽署知情同意書者。

1.3 關節液采集 選擇皮膚完整處進行穿刺，常規消毒鋪巾。髕骨外上方穿刺，可由股四頭肌腱外側向內下刺入關節囊；髕韌帶旁穿刺，可由髕骨下方膝眼處向后刺入關節囊；若上述穿刺失敗，可在超聲引導下進行穿刺抽液。抽取2份關節液，每份2 ml，1份進行常規細菌培養，1份進行NGS檢測。

1.4 細菌培養 關節液行常規需氧和厭氧菌培養；培養基分別為血平板、巧克力平板及BacT/Alert FN血培養瓶；培養板放置于恒溫37.0℃培養箱，血培養瓶置于梅里埃血培養箱。所有標本培養1周。

1.5 NGS測序

1.5.1 樣品保存 按照標準程序所采集的關節液即刻冷凍，保存溫度為-20℃。

1.5.2 DNA提取、文庫構建及測序 采用TIANamp微DNA試劑（DP316，天根生化科技有限公司）直接從關節液中提取DNA。通過DNA片段化、末端修復、連接和PCR擴增構建DNA文庫。Agilent 2100用于DNA文庫的質量控制。通過BGISEQ-50平臺對質量合格的DNA文庫進行排序[6]。

1.5.3 數據處理與分析 通過去除低質量、低復雜度、短于35 bp的讀數得到高質量測序數據。利用BurraveWeler-Read數據處理和分析消除人類序列的影響[7]。然后將剩余的數據對準微生物基因組數據庫，微生物基因組數據庫包括細菌、病毒和真菌等目前可以知曉的所有微生物。刪除重復讀取獲得映射數據，保留并最后分析高級數據。其中微生物基因組數據是從美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）下載（FTP://FTP.NCBI.NLM.NIH.gov）[8]。本研究所用數據庫包含2 473個細菌屬、4 061個與人類疾病相關的病毒種類、199個與人類感染相關的真菌種類和135個與人類疾病相關的寄生蟲，其資料來自SOAP網站（http://SOAP.GnEngor.org.cn）[9]。對細菌含量占總序列＞1%的細菌屬進行統計。

1.6 統計學處理 采用SPSS 15.0統計軟件。計數資料以例數（率）表示，組間比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 15例患者關節液細菌培養和NGS檢測結果

2.1.1 細菌培養 15例TKA術后關節感染患者微生物培養陽性10例（其中例4同一標本培養出2種細菌），分別培養出表皮葡萄球菌4例，金黃色葡萄球菌2例，停乳鏈球菌1例，黏液奈瑟菌1例，無乳鏈球菌1例，脆弱擬桿菌1例，大腸埃希菌1例；培養陰性5例，見表1。

2.1.2 NGS檢測 15例患者關節液中均發現細菌，其中例1至例10 NGS檢測細菌菌屬與細菌培養結果一致。除了例4外，其余9例NGS檢出的優勢菌群與細菌培養結果一致。例7、8、9 NGS檢測僅檢出1種細菌屬，且均與細菌培養結果一致。細菌培養陰性的5例中，例11檢出1種細菌，為大芬戈爾德菌（85.69%），例12僅檢出鏈球菌屬（76.98%），例13檢出2種細菌，為葡萄球菌屬（90.38%）和奈瑟菌屬（10.62%），例14僅檢出厭氧菌屬（89.27%），例15僅檢出念珠狀鏈桿菌（79.85%），見表1。

表1 15例患者關節液細菌培養和N G S檢測結果

2.2 關節液細菌培養與NGS檢測結果的比較 在細菌培養陽性的10例標本中檢出細菌屬種類10種，NGS檢出細菌屬種類15種，兩者比較差異有統計學意義（P=0.042）；其中9例標本NGS檢測出的優勢菌群（豐度最高）與細菌培養一致。在細菌培養陰性的5例標本，NGS均檢出細菌，其中例11、14和15為苛養菌。

3 討論

PJI是人工關節置換術后的嚴重并發癥，給患者帶來了巨大的經濟、心理負擔，增加患者術后病死率。PJI的發病率在全髖關節置換術后約為1%，而TKA后約為1%～2%[10]。流行病學調查研究顯示，PJI已經成為髖關節翻修術的主要原因之一[11]，也是膝關節置換術后翻修的首要原因[12]。治療過程艱巨，治療結果往往較差。為了最大限度地發揮治療效果，必須準確識別病原體，正確的病原體鑒定對于獲得抗生素敏感性和減少抗生素的應用范圍是必要的[13]。傳統的關節液穿刺抽取培養已經成熟，但仍存在一些缺陷。有文獻報道PJI假體周圍組織培養陽性率僅55.73%[14]。本研究結果發現，關節液培養陽性率為66.67%（10/15），與上述文獻報道的培養陽性率接近，細菌培養陽性率不高。同時細菌培養所需的時間非常久，一般需要培養5 d，甚至更長時間才能得到細菌菌落[15]，影響抗生素的早期使用。但傳統的培養方法無法檢測到已經形成生物膜的微生物，或者已經在成骨細胞中被內化的微生物。標本中病原體的數量也會影響培養結果的準確性。此外，許多存在感染表現的患者常在獲得液體樣品之前進行了經驗性抗感染治療，而關節液穿刺抽取前的抗生素治療可能產生假陰性培養物[16]。本研究培養陰性的5例標本中，例12和例13檢查前使用抗生素。另外某些苛養菌不易培養。鑒于這些缺點，人們不得不探索更靈敏的檢測方法來檢測關節液中的PJI證據。

NGS檢測是一種簡單、復雜的快速、準確的分子診斷方法。在每個操作中產生數百萬至十億個DNA/RNA序列的能力使得宏基因組分析比傳統的Sanger測序具有顯著的優勢。它是一個無偏的分析，因為它可以放大和測序樣品的整DNA含量，而不使用任何引物或探針。理論上，無偏NGS有助于在一次測定中識別所有潛在的病原體。目前已釋放出43 000余株微生物基因組，包括38 000種細菌和5 000種病毒[17]，這些數據還含有人類病原體的重要代表，它們的可用性將對微生物病原體NGS檢測和應用產生重大影響[17-18]，有助于識別常見、罕見甚至新病原體。理論上，幾乎所有病原體都可以根據長讀數的長度、微生物基因組的生命數、核酸的特定序列以及參考數據庫的完整性來確定。黃子達等[19]利用NGS檢測在假體周圍感染中的病原菌，結果發現關節液NGS診斷敏感度明顯高于關節液培養及組織培養。在本研究中，所有標本NGS檢測均發現細菌，陽性率為100%，遠高于細菌培養的66.67%，結果同黃子達等[19]一致。在例4中，細菌培養中發現2種細菌，而NGS發現8種細菌；在例6中，細菌培養發現1種細菌，而NGS發現5種細菌。這2例患者為慢性感染患者，在取材之前經多種抗生素的不規范治療，說明抗生素濫用導致多重細菌混合感染可能。例7、8、9、10系早期感染，例7術前存在牙周炎，例8術前存在尿路感染，說明關節置換術前要排除全身是否存在感染灶。例1、7的皮膚均有破潰流膿，考慮細菌毒力強，細菌培養提示金黃色葡萄球菌生長，同時在例1中，NGS檢出3種細菌，考慮外界環境中的細菌可能通過破潰口污染關節液。在細菌培養陰性的5例標本中，發現例12、13術前使用抗生素，術前抗生素的使用影響培養的結果，而NGS可以直接讀取抗生素滅活細菌的殘留DNA。例11、14和15 NGS結果提示為苛養菌，可根據NGS結果選擇合適培養基后進行再次細菌培養和藥敏試驗。

同時，NGS存在許多不足之處：（1）僅能提示某種細菌感染，而無法給出對于臨床治療所需要的細菌藥物敏感。故目前臨床上可根據NGS的結果提示，選擇NGS所提示的細菌選擇合適的培養基再次培養，并進行藥敏試驗；（2）NGS的靈敏度過高，對于已經被滅活的細菌殘留DNA，亦能進行讀取，故降低了診斷的特異性；（3）NGS需要進行標本的DNA提取、文庫構建及測序，過程較為繁瑣，并且一個流程的失敗，將導致整個讀取的失敗；（4）相對于傳統的細菌培養，NGS的費用較多，不適用于普及開展。

綜上所述，NGS是一種快速、準確的的診斷方法，為常規細菌培養方法的補充，能檢出細菌培養以外的細菌，特別對于細菌培養陰性的標本更具診斷意義。