T2DM心肌纖維化與miRNAs靶點endoglin關聯性研究△

湛 慧 陳秋玲 李 寬

(深圳市人民醫院藥學部 深圳 518000)

microRNAs是由20～23個核苷酸構成的天然調節因子，它通過主抑制mRNA翻譯或促進分解來達到調節作用。多項研究顯示，miRNAs在心血管領域特別是心肌纖維化方面發揮著重要作用[1～3]。miRNAs可激活多個通路，促正常成纖維細胞出現病理分化，觀察miRNA-21的表達水平以及纖維化標志物的變化，發現Ⅰ型膠原與纖維連接蛋白呈現一定的相關性[4]。miRNA-29b可對結締組織生長因子、基質金屬蛋白酶、I型膠原起到負性調節效果，而達到調節心肌纖維化進程[5]。研究表明，在心肌肥大模型中，miRNA-1和miRNA-133可以調節異常的表現，另外也可調控心肌細胞的凋亡[6]。因此，通過miRNA在心肌纖維化領域的機理或許能為臨床治療新的目標靶點。mRNA調控的復雜性，目前對miRNA的研究還處于探索階段，因此，本研究希望發現更多與心肌纖維化相關的miRNA。

1 實驗方法

選取40只雄性C57BL/6小鼠，按照隨機數字原則進行分組：對照組10只、DM組30只。DM組腹腔注射STZ(40mg/kg/D)5d做T2DM建模，對照組不做特殊處理。處死小鼠后，取兩組小鼠部分心肌組織用于制作組織切片，放入4%多聚甲醛中，并采用Masson、HE染色處理。采用酒精脫水處理后，制作為蠟片，所有蠟片為4μm薄片，并經40℃熱水進行預熱并做燙平處理，然后放入45℃恒溫箱子中晾干后，保存于4℃環境。

1.1 HE染色

切片進行烘烤處理，烘烤溫度60℃，時間為1h，依次放入二甲苯I、二甲苯Ⅱ、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇和70%乙醇，最后用蒸餾水沖洗。依次采用蘇木素、伊紅染液作染色處理，脫水后采用中性樹脂進行封片處理，并經光鏡查看，及時拍照記錄。

1.2 Masson 染色

將切片于60℃烘烤1h，脫蠟至水。用鐵蘇木素、藍化液、麗春紅染液和苯胺藍依次染色，脫水后用中性樹脂封片，再用光鏡觀察并拍照記錄。

1.3 Western-blot

完成組織總蛋白的提取，取少量心臟末端，放入先配制的組合分解液，研磨30s后，將EP管置于冰上0.5h，于4℃環境下作離心處理，離心時間為10min，離心轉速為12000rpm，保存在-80℃環境下，再計算吸光度值、檢測蛋白濃度。調配濃縮膠與分離膠，制備好的蛋白質樣品經SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳。樣品兩端分別放入5μL蛋白標記物，保留30min后，待Marker完全分開且目的蛋白跑到合適位置后，結束電泳，進行轉膜，再封閉1h。一抗孵育和二抗孵育結束后，在顯影液中將膜浸泡1 min進行顯影，并用軟件分析灰度值。

1.4 RNA提取

將心臟末端分別加上1mL Trizol，研磨30s后，轉移到1.5mL EP內，在冰上分解10min，分別加上200μL的氯仿15s劇烈晃動，變成乳濁液，用12000rpm，離心5min，離心環境44℃，按照1∶1比例加入等量上清異丙醇，按照12000 rpm速度、離心10min，放入適量DEPC水溶解進行沉淀，檢測濃度、純度，設置空白對照組DEPC水，純度標準為A260/A280時為1.8～2.0時。

1.5 RNA逆轉錄

去除DNA：

試劑組分體積(μL)4 × gDNA wiper Mix4primer1模板RNATotal RNA:1pg-1μgRNase free dd H2Oto 16

逆轉錄反應：

試劑組分體積(μL)5x HiScript II qRT SuperMix II4第一步反應液16

引物序列：

引物名稱序列(5’-3’)miRNA-138-5p RTCTCGCCAGTCTCCCGAGCGGCGCCCTACACTGGATACGACCGGTTCGCCTU6 RTCCCCCACCACACTGAATCTCTGCC

PCR擴增：

試劑組分體積(μL)2×SYBR10模板c DNA(稀釋2倍)2Forward primer1Reverse primer1RNase free ddH2O6

目的基因引物序列：

GenesForward primerReverse primermi RNA-138-5P5’-GAGGCTAGCTGGCCCGTTTC-3’5’-TGGCCAAGGTCATCCATGACA-3’U65’-AGCTCACTGGCATGGCCTTCGCG-3’5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’CollagenⅠ5’-GGACCTCATGGCCCACATGG-3’5’-TACAGGTTGAAGAGCTTCTGGC-3’CollagenⅢ5’-GGAAGAGAGAGACCCTCACT-3’5’-CGACAGCTGACTTGCTGAGA-3’Endoglin5’-GGACCTCATGGCCCACATGG-3’5’-TCATCCATGACAACTTTGGT-3’GAPDH5’-AGGAAGAGAGAGACCCTCATGC-3’5’-GACTGTGGATGGCCCTGCTC-3’

2 實驗結果

結果觀察顯示，紅色為正常心肌細胞，期間可見散裝分布的膠原纖維，呈藍色。在對照組中可見完整良好的心肌結構，緊密且規律，形態完好；相比之下，DM組可見病理性特征，細胞排練紊亂，間質疏松，可觀察到炎性細胞浸潤和纖維細胞增生。正常對照組心肌組織膠原纖維少，分布均勻，見圖1 。

圖1 HE染色及Masson染色分析小鼠心肌組織病理變化

免疫組化結果顯示，DM組小鼠心肌組織中CollagenⅠ、CollagenⅢ及Endoglin蛋白可見異常表達，分別升高了0.63倍、1.06倍和1.16倍，結果有統計學差異，見圖2 A和B；相比于對照組，DM組中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ及Endoglin的mRNA表達異常，水平分別為CON組的1.36倍、0.79倍和1倍，結果有統計學差異(P<0.05)；DM組miRNA-138-5p的水平較CON組下降了68.7%，結果有統計學差異(P<0.05)，見圖2C和D。

圖2 免疫組化結果分析

3 討論

根據流行病調查，糖尿病發病率逐年升高，隨著病情惡化發展，糖尿病患者并發癥發生率增加，其中一個常見的并發癥為心肌纖維化，會加重患者致死率[7]，表現為大量心肌成纖維細胞。心肌纖維化的發病機制可理解為：在TGF-1/Smads信號路徑上，首先TGF 1與T受體RⅡ結合形成二聚體，激活T受體RI被激活，與TGF-1結合，作用于Smads蛋白的C端，也就是絲氨酸殘基。當激活磷酸化后，Smad2/3以及Smad4被激活形成轉錄復合物[8～10]。內分泌素(Endoglin，CD105)主要處于內皮細胞[11]，為轉化生長因子超家族TGF-的Ⅲ型輔助受體[12]。該激素為TGF-的輔助受體，通過作用于TGF下游的調控途徑，參與膠原I的合成，從而促進心肌纖維化[13]。內分泌素通過心肌成纖維細胞中的TGF-I受體，同時產生激活和抑制Smad1&5的雙重作用，平衡TGF信號通路平衡[14]。我們推測并驗證Endoglin可能會作為必要信號因子抑制TGF-1信號轉導，而這一過程是選擇性的，在Human-CFs(人心肌成纖維細胞)TGF-1信號轉導中抑制膠原蛋白合成，從而減輕心肌纖維化[15]。

近年來，miRNA-138-5p的研究主要集中在口腔癌，胰腺癌、肺癌等癌癥研究領域[16～18]，但罕見于心肌纖維的報道。研究顯示一個microRNA可以有多個靶點，同一靶點基因也可以受到多個microRNA的生物學調控。因此，Endoglin可能是miRNA-138-5p的調控靶點，并影響心肌纖維化。