E2F轉錄因子家族對肝細胞癌診斷及預后價值的研究

寧晶璇

（山西省運城市中心醫院內科，山西 運城，044000）

0 引言

在全球范圍內，肝細胞癌是第7大常見癌癥，也是全球癌癥相關死亡的第2大原因[1]。肝細胞癌因其起病隱匿、早期浸潤生長并遠處轉移等特點使大部分患者就診時已失去根治性手術機會，嚴重影響患者預后[2]。近年來已經開展了大量針對肝細胞癌分子靶向治療及免疫治療的研究，但是隨著藥物的臨床運用，耐藥率逐漸上升，肝細胞癌的總體發病率仍在不斷增加[3]。因此研究肝細胞癌的發生發展機制，尋找肝細胞癌診斷和預后標志物及治療靶點具有重要的意義。

E2F轉錄因子家族（E2Fs）是生物體中極其重要的一組轉錄基因，在細胞增殖、凋亡、分化、衰老、DNA損傷反應和DNA修復中發揮重要作用[4,5]。近年來研究發現一些E2F轉錄因子家族對多種惡性腫瘤發生發展的作用和特點[6-9]。本研究對肝細胞癌中8個E2F轉錄因子進行了深入而全面的生物信息學分析，并基于幾個大型公共數據庫評估了其作為診斷和預后生物標志物的潛力，從而為臨床醫生選擇合適的治療靶點和更準確地預測肝細胞癌患者的長期預后提綜合數據。

1 資料與方法

1.1 分析E2Fs在肝細胞癌組織中轉錄表達水平及臨床病理參數

UALCAN數據庫(http://ualcan.path.uab.edu/) 是一個基于TCGA數據庫的在線分析和挖掘癌癥數據的網站工具[10]。本研究通過運用UALCAN數據庫檢測分析E2Fs在肝細胞癌中轉錄水平表達以及其與肝細胞癌腫瘤分期和分級的關系。

1.2 分析E2Fs在肝細胞癌組織中蛋白表達水平

HPA數據庫(https://www.proteinatlas.org/) 是一個蛋白質數據庫，旨在利用各種組學技術繪制人類蛋白質的組織和細胞分布信息[11]。本研究從人蛋白質圖譜中尋找并提取了肝細胞癌組織和正常肝組織中E2F1/2/8免疫組化圖像進行比較。

1.3 分析E2Fs與肝細胞癌患者預后的關系及檢索E2Fs相似基因

GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/) 是一個基于TCGA基因表達數據動態分析和可視化的網站，提供腫瘤與正常組織的差異表達譜分析、病理分期、患者生存分析、相似基因的檢測與分析[12]。本研究從GEPIA數據庫中獲得E2Fs在OS和RFS肝癌患者中表達的預后數據并進行統計學分析。同時利用GEPIA數據庫檢索E2Fs的相似基因進行富集分析。

1.4 E2Fs及其相似基因的GO和KEGG富集分析

DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/) 是一個生物信息數據庫，目前的版本是david6.8，它可以為大規模的基因或蛋白質列表提供全面的生物功能注釋信息，幫助用戶從中提取生物信息[13]。本研究在david6.8數據庫中用GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of genes and Genomes）對肝細胞癌中不同表達的E2Fs和160個相鄰基因進行了富集分析。

1.5 統計方法

表達水平采用Student’s t-test，P<0.05提示有顯著性差異。生存分析采用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 E2Fs在肝細胞癌中的表達情況

為了解E2Fs在肝細胞癌組織中的表達情況，我們運用UALCAN數據庫對肝細胞癌組織和正常組織中的E2Fs的mRNA水平進行比較。結果發現肝細胞癌組織中E2F1/2/3/4/5/6/7/8的mRNA表達量與正常組織相比明顯升高（均P<0.001）（見圖1）。接著我們應用HPA數據庫探索E2Fs在肝細胞癌中的蛋白表達水平，在HPA數據庫中我們找到了E2F1,E2F2和E2F8在內的3個E2F轉錄因子家族成員在肝細胞癌中的免疫組化結果，我們發現E2F1的蛋白表達水平明顯高于正常組織，而E2F2和E2F8的蛋白表達水平與正常組織沒有顯著差異（見圖2）。

圖1 E2Fs 在肝細胞癌組織中的表達情況（＊＊＊P<0.001）

圖2 E2F1/2/8在肝癌組織中免疫組化結果

2.2 E2Fs與肝細胞癌腫瘤分期和分級的關系

在發現E2Fs家族成員在肝細胞癌組織轉錄水平高表達后，我們利用UALCAN數據庫分析E2Fs 轉錄水平與肝細胞癌腫瘤分期和分級的關系。結果提示：總體來說，在肝細胞癌腫瘤分期中E2Fs表達水平均隨著腫瘤分期的增加逐漸升高。E2F1/2/3/6/7/8表達量均在3期最高，E2F4，E2F5表達量在腫瘤4期的表達量最高。（可能是因為腫瘤4期包含的樣本量過于少的緣故。）在腫瘤分級中E2Fs的表達水平隨著腫瘤分級的增加逐漸升高（見圖3、圖4）。提示E2Fs 轉錄水平隨著肝細胞癌腫瘤分期和腫瘤分級的增加而升高，提示E2Fs的轉錄水平與肝癌患者的臨床病理階段明顯相關。

圖3 E2Fs與肝細胞癌腫瘤分期關系 ＊P<0.05,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001.

圖4 E2Fs 與肝細胞癌腫瘤分級的關系 ＊P<0.05,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001

2.3 E2Fs與肝細胞癌患者生存期的關系

我們應用GEPIA數據庫探索E2Fs的轉錄水平與肝細胞癌患者總生存期（OS）和無復發生存期（RFS）的關系。分析結果提示高表達E2F1/2/5/6/7/8的肝細胞癌患者的OS明顯低于低表達的患者，而高表達E2F3/4的肝細胞癌患者的OS與低表達患者沒有明顯區別。對于RFS而言，高表達E2F1/2/3/5/6/7/8患者的RFS明顯低于低表達者，而E2F4的表達與肝細胞癌患者的RFS無明顯關系（見圖5）。提示低表達E2F1/2/5/6/7/8的肝細胞癌患者OS和RFS預后較好，提示E2F1/2/5/6/7/8可能成為肝細胞癌的獨立預后生物學指標。

2.4 E2Fs及其相似基因富集分析

接下來我們運用生物信息學中的比對思想，即與目標基因越相似的基因越有可能發揮相應的功能。利用GEPIA數據庫尋找與E2Fs的相似基因160個（每個E2F成員找最相似基因20個，共160個相似基因）。利用DAVID數據庫對E2Fs及其相似基因進行GO和KEGG分析。通過GO分析將靶標基因在細胞組分（CC）、分子功能（MF）和生物學過程（BP）中進行富集分析，通過統計學方法找到最顯著富集的生物學注釋。通過KEGG分析富集靶標基因產物在細胞中所在的通路。

GO分析結果提示：富集最多的細胞組分（GO:CC）是：細胞核、核質、細胞質、細胞質、細胞質、膜、核仁、中心體、微管及轉錄因子復合物；富集最多的分子功能（GO:MF）是：蛋白質結合、DNA結合、ATP結合、多聚（A）RNA結合、RNA結合、核苷酸結合、酶結合、微管結合、核心啟動子結合、單鏈DNA依賴性ATP酶活性和DNA鉗夾加載器活性；富集最多的生物學過程（GO:BP）是：細胞分裂、DNA復制、有絲分裂核分裂、DNA修復、mRNA剪接、通過剪接體、有絲分裂細胞周期的G1/S轉換、細胞對DNA損傷刺激的反應、姐妹染色單體內聚、DNA損傷反應和p53類介導的信號轉導導致細胞周期阻滯。

KEGG分析發現：在E2Fs及其相關基因可能通過參與細胞周期、癌中的MicroRNAs、DNA復制、錯配修復、核苷酸切除修復等通路，參與肝細胞癌的發生和進展（見圖6）。

圖6 E2Fs及其相似基因富集分析結果

3 討論

肝細胞癌是全球常見的惡性腫瘤之一，我國是肝癌大國，肝細胞癌的發病率和死亡率均超過全世界50%[14]。隨著第一代肝細胞癌分子靶向藥物多靶點酪氨酸酶抑制劑索拉菲尼上市，開啟了肝細胞癌分子靶向治療的新時期，PD-1單抗等免疫治療藥物被FDA批準上市運用于臨床，為腫瘤晚期、無手術機會的肝細胞癌患者帶來了希望[15]。但隨著靶向藥物的臨床應用，耐藥的發生率逐漸升高，上述分子靶向治療藥物及免疫治療藥物的整體有效率依然有限，診斷和預后的分子靶標依然缺乏。

近年來已有許多的研究評估E2F轉錄因子的表達在肝細胞癌中臨床價值，但對E2F轉錄因子家族在肝細胞癌中的診斷及預后作用的研究仍不全面。本研究對E2Fs在肝細胞癌中的表達、腫瘤分期分級、預后等方面進行深入分析及研究，為臨床尋找新型肝細胞癌診斷和預后標志物及治療靶點提綜合數據。

E2F1是經典的E2F轉錄因子家族成員，也是E2F家族中研究最深入的成員。它通過編碼轉錄調節因子，在細胞周期G1期/S期轉變過程中扮演著重要角色。本研究通過運用生物信息數據庫分析發現E2F1 mRNA水平和蛋白水平在肝細胞癌中高表達，并且高表達E2F1的肝細胞癌患者具有更差的生存期。結果提示E2F1可能為肝細胞癌診斷及預后的標志物。E2F2是E2F轉錄因子家族成員之一，對細胞的增殖、分化和凋亡等相關細胞功能有一定的影響。有研究表明E2F2在肝細胞癌組織中表達上調，miR-218可通過抑制肝細胞癌中的E2F2,從而抑制肝癌細胞增殖[17]。本研究發現E2F2在轉錄水平在肝細胞癌組織中高表達，且其表達水平與肝細胞癌患者的生存期密切相關。本研究發現E2F3、E2F4mRNA在肝細胞癌組織中明顯升高，但與肝細胞癌的預后無顯著性差異，提示E2F3，E2F4對肝細胞癌的預后預測作用可能較弱。

近年來多項研究提示E2F5、E2F6、E2F7和E2F8在多種惡性腫瘤中發揮作用，其中有研究發現F2F5與CDK13相互作用促進前列腺癌細胞的增殖并抑制其凋亡[19]；E2F6在惡性黑素瘤中高表達，敲減A375細胞E2F6基因可能通過拮抗β聯蛋白信號抑制細胞增殖、遷移和侵襲[20]。另外，Moreno等在對成年大鼠進行研究時發現E2F7是肝細胞癌生長抑制因子[7]；E2F8在甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達，且與其病理分期呈正相關[21]。本研究通過綜合分析發現E2F5/6/7/8在肝細胞癌中高表達，且表達水平與肝細胞癌的臨床分期及分級相關。低表達E2F5/6/7/8的肝細胞癌患者具有更高的生存期，提示E2F5/6/7/8同時具有診斷和預后預測作用。

綜上所述，本研究通過分析E2F轉錄因子家族8個成員在肝細胞癌組織中的表達、與臨床分期分級的關系、與肝細胞癌患者預后的關系，發現在轉錄水平上E2Fs在肝細胞癌組織中高表達，并且與肝細胞癌的臨床病理分期明顯相關。低表達E2F1/2/5/6/7/8的肝細胞癌患者OS和RFS預后較好，提示E2F1/2/5/6/7/8可能成為肝細胞癌的獨立預后生物學指標。GO和KEGG富集結果提示E2F轉錄因子的功能主要集中在細胞周期調控方面，提示E2Fs可能通過細胞周期的轉換促進腫瘤的發生發展。這些結果說明，E2F1/2/5/6/7/8可能作為肝細胞癌的獨立生存預后指標，從而為臨床中尋找肝細胞癌靶基因及靶向藥物提供新的線索和思路。