HO-1在急性骨筋膜室綜合征中的表達及臨床意義的研究

鄭鐵軍，黃釗，凌赫，蘇偉*

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院創傷骨科手外科，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學廣西生物醫藥協同創新中心，廣西 南寧 530021）

0 前言

急性骨筋膜室綜合征( acute compartment syndrome，ACS)是臨床上常見的急癥之一[1]。ACS是創傷或其他導致出血、水腫或影響肢體的灌注疾病的并發癥。四肢骨折或擠壓傷是ACS最常見的原因[2]。骨折、擠壓傷或肢體缺血后由于血液和液體的積聚，肢體發生進行性腫脹。ACS 是由于閉合的筋膜室內壓(intracompartmental,ICP)升高，引起微循環障礙繼而引起肌肉、神經損傷[3]。由于肌肉筋膜和其他結締組織是非彈性的，這種增加的腫脹會導致ICP的增加，并傳遞到薄壁靜脈，導致靜脈高壓和進行性組織缺血。隨著細胞死亡的開始，細胞膜溶解釋放出滲透活性的細胞內容物進入間質，導致液體進一步堆積，室內壓力進一步增加。微動脈灌注也可能受損，導致微血管塌陷。組織血流阻斷，最后會發生惡性循環的結局[缺血-水腫-缺血][4]。組織的新陳代謝需求得不到滿足，導致活性氧（Reactiveoxygen species，ROS）和其他炎癥介質的增加，不僅會使組織的損傷得以加重[5,6]，而且還會干擾肌肉組織的再生和修復。ACS的唯一有效治療方法是立即手術筋膜切開術，松解皮膚和肌肉筋膜，降低筋膜間壓力。

到目前為止，血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）已有兩種亞型HO-1和HO-2在哺乳動物中被報道，第三種HO-3是由Hayashi和他的同事提出的，而在植物中發現了四種亞型(HO-1，HO-2，HO-3和HO-4)[7]。在不同的HO亞型中，HO-1因其表達水平在不同的病理生理條件下被誘導而被認為是最受關注的研究對象。HO-1催化血紅素降解為一氧化碳(CO)、亞鐵和膽綠素，然后被膽綠素還原酶迅速還原為膽紅素。研究表明，HO-l是能有保護作用，抵抗氧化性損傷的內源性物質[8]。HO-l的轉錄受多種應激源的觸發，包括血紅素、缺氧、氧化應激和紫外線照射[9]。HO-l在觸發后產生，會發揮抑制炎癥反應、減少氧化反應、以及抗細胞凋亡等效能使得機體受到保護作用[10,11]。在反應后的生成物中,其中膽紅素可以起到使過氧化反應變弱的作用,而在CO存在的情況下，可以激活鳥苷酸環化酶，有環磷酸鳥苷生成[12]。如果組織器官發生缺血性損傷,例如肢體發生缺血-再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）后，HO-1 會生成增多[13],這樣就會相繼引起CO生成增多，最終肢體的缺血性損傷會得以減弱[14],CO在幾種體外和體內炎癥模型中被認為是一種有效的抗炎劑[15]。一般認為，外源性的CO的可發揮保護作用，可以使后肢肌肉的缺血性損傷得以減弱，這在大鼠[16]和小鼠[17]上得以體現。更有表明，這種理論可能適用于在缺血性肌肉中HO-1產生的內源性CO[9]。

Ewing和他的同事通過觀察心臟對高溫的反應增加了HO-1的表達，首次證明了HO-1在維持心臟內穩態方面的主要作用[15]。此外，許多HO-1轉基因小鼠模型的研究表明，由于HO-1的表達，IRI后心肌梗死面積減少[18]。此外，在心力衰竭模型中，表達的HO-1促進新生血管并改善細胞凋亡[19]。腎臟會遇到不同的毒素，既有外源性的，也有內源性的。游離血紅素是誘導氧化應激并最終導致HO-1表達的主要分子。已經觀察到HO-1的表達發生在腎間質、近端小管、腎單核巨噬細胞和腎小球等不同的亞結構中，作為對損傷的反應[20]。HO-1的表達與動物IRI后腎功能的恢復有關[21]。

然而迄今為止，HO-1在骨骼肌損傷，尤其是急性骨筋膜室綜合征中的相關研究較少。本研究通過二代高通量測序比較發生骨筋膜室綜合征和未發生骨筋膜室綜合征的基因表達差異，運用生物信息學方法分析HO-1mRNA 在骨筋膜室綜合征中的表達及臨床意義。然后通過RT-qPCR技術驗證HO-1mRNA的差異表達，利用GO富集分析和蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡分析探索急性骨筋膜室綜合征發生后，HO-1具體相關作用方向，初步探討 HO-1參與急性骨筋膜室綜合征的潛在分子機制。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

提RNA試劑盒、cDNA 逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR（RT-qPCR）來自生工生物工程（上海）有限公司；美國Thermo Fisher公司的NanoDrop微量核酸蛋白分析儀；美國Thermo Fisher公司的7500實時熒光定量PCR儀。

1.2 建立動物模型

1.2.1 急性骨筋膜室綜合征動物模型

包括：結扎部分和監測部分。結扎部分包括：棉線和血管鉗。棉線用于扎住大鼠的大腿根部，血管鉗有助于結扎打結時固定；監測部分包括：頭皮針（8#），一次性輸液器，生理鹽水（100 mL/瓶），一次性壓力傳感器（PX2600YZB/USA 3717-2015），心電監護儀（如：邁瑞 115-021306-00/PHILIPS）。頭皮針與生理鹽水通過一次性輸液器連接在一起，然后與壓力換能器通過三通管相連，壓力換能器與心電監護儀相連，通過心電監護儀讀取ICP和舒張壓（diastolic blood pressure，DBP），即可計算△ p（△ p=DBP-ICP）。

1.2.2 急性骨筋膜室綜合征模型建立過程

a.400-500gSD大鼠，實驗前12h動物禁食，不禁水；

b.實驗時，大鼠稱重，腹腔內注射水合氯醛麻醉，水合氯醛濃度10%，用量30-50mg/kg實驗期間水合氯醛維持麻醉狀態；

c.在大腿根部用軟尺測量膝關節周長C1,用棉線靠近根部扎住大腿來阻斷下肢血流，用血管鉗協助固定打結，使結扎后的大腿根部周長為C2=C1×1/2；

d.△p具體測量步驟如下。

給大鼠下肢剃毛，常規消毒后，取大鼠踝關節上方1cm部位作為穿刺點，行斜45°穿刺、按照垂直測壓方法測壓,直至水柱平衡并通過三通管暫時關閉水柱；

用垂直水柱測壓裝置與壓力換能器通過三通管相連，壓力換能器通過心電監護儀電纜線與心電監護儀相連，將壓力換能器放置于被測肢體同一水平并調零；

打開三通管將垂直水柱與壓力換能器相通，通過心電監護儀讀取ICP；

使用留置針行頸動脈穿刺，留置輸液軟管在頸動脈內，用同樣的方法監測DBP；

計算△p 。

先觀察12h,若其間△P<30mmhg,持續時間>2h,則視為模型建立成功，可確診ACS的發生，若12h后仍達不到△P <30mmhg，則在第一次結扎的相同位置進行第二次結扎，使結扎后的大腿根部周長為C3=C1×1/2；然后繼續監測直至△P <30mmhg,持續時間>2h。

圖1 動物模型的結構示意圖

1.3 實驗分組

實驗分為2組：實驗組和對照組，實驗組給予造模處理，對照組不做任何處理。

1.4 測序分析

實驗組和對照組各2只大鼠，當實驗組大鼠△P <30mmhg,持續時間>2h，診斷ACS的發生，造模成功。取大鼠小腿的趾長屈肌，做二代高通量測序。總RNA是使用miRNeasy Mini Kit (德國)提取的。cDNA文庫構建和測序是使用Illumina HiSeq2000測序儀在上海生物技術公司(中國上海)進行。由此產生原始測序片段被映射到Sscrofa11.1的參考基因組上。轉錄本的表達以FPKM（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads)來量化。使用EdgeR鑒定了基因的差異表達水平[22]。使用q-Value BioConductor軟件包，通過控制FDR（False Discovery Rate），對基因的差異表達的P值進行調整。p值為≤0.05且倍數變化≥2的基因被定義為差異表達基因（differentially expressed genes,DEGs）。使用ClusterProfilerR軟件包對DEGs進行GO功能富集分析和KEGG途徑富集分析。如果p值≤為0.05時，這些條目被認為是顯著豐富的。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡分析

使用STRING在線工具(https://string-db.org/cgi/input.pl))構建置信分數>0.4的DEGsPPI網絡[23,24]。然后，我們將HO-1基因和其相關基因的數據導入Cytoscape（版本3.6.0，http://chianti.ucsd.edu/cytoscape-3.6.0/）來分析它們及其編碼蛋白的相互作用關系，并進行可視化處理。

1.6 RT-qPCR法測定

實驗組和對照組各5只大鼠，當實驗組大鼠△P<30mmhg,持續時間>2h，診斷ACS的發生，造模成功。檢測HO-1的基因表達水平，根據生工生物工程試劑盒說明書提取大鼠小腿的趾長屈肌總RNA并測定濃度，通過使用cDNA轉錄試劑盒反轉獲得cDNA。參照qPCR試劑盒的操作說明進行qPCR產物擴增，使用2-??Ct法實現相對基因表達水平的分析，并將基因表達水平標準化為β-actin,計算HO-1mRNA表達量。qPCR反應程序（三步法）：預熱期：95℃ (30s)；循環期：95℃ (5s)，60℃ (34s)，共循環 40次；溶解期：95℃ (15 s)，60℃ (60 s)，95℃(15s)。引物購自生工生物工程股份有限公司，具體如下：β-actin 上 游 : 5’-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3’，下 游：5’-AGCCACCAATCCACACAGAG-3’；HO-1上 游：5’-TTTCACCTTCCCGAGCATC-3’， 下 游 :5’-TCTTAGCCTCTTCTGTCACCCT-3’

1.7 統計學分析

使用SPSS 26.0軟件對數據進行統計分析，使用秩和檢驗比較RT-qPCR中實驗組和對照組的HO-1mRNA表達差異從而得出P值，如果P<0.05，則認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異表達基因(DEGs)的鑒定與功能富集分析

基于實驗組和對照組的測序數據，我們獲得了1915個DEGs。和對照組相比，實驗組中780個上調基因，1135個下調基因（詳見附件1）。在圖2中，熱圖和火山圖顯示這些基因是有明顯差異表達的(圖2A，2B)。圖2C和2D中顯示了GO富集和KEGG富集分析結果。在實驗組中，差異基因HO-1表達上調（圖2E），表2（詳見附件2）顯示HO-1富集的GO條目：過氧化氫的反應、缺氧的反應、活性氧的反應、細胞金屬離子的反應、細胞氧化應激的反應、防御反應、細胞脂質代謝過程。其中顯示201個DEGs富集在防御反應，51個DEGs富集在氧化應激反應。這些結果提示急性骨筋膜室綜合征中HO-1表達升高可能與防御反應和氧化應激生物過程有關。

圖2

表1 HO-1相關的GO條目

2.2 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡分析

為了進一步研究在急性骨筋膜室綜合征中HO-1參與的機制，根據STRING數據庫中的數據，建立了一個PPI網絡。我們從中篩選出HO-1與其相關基因進行分析，使用Cytoscape進行可視化處理，總共有59個節點和58個關系對(圖3)。結果發現這些基因大多在防御反應和氧化應激GO條目中富集。這又一次說明，在急性骨筋膜室綜合征中HO-1參與的機制可能與防御反應和氧化應激方面有關。

圖3 HO-1（Hmox1）與相關基因的PPI網絡

2.3 RT-qPCR技術在基因表達分析中的驗證

從測序結果中，我們發現HO-1是DEGs之一，我們利用RT-qPCR技術驗證HO-1mRNA 在實驗組和對照組中的表達差異。與對照組相比，HO-1mRNA在實驗組中的表達確實顯著上調(P<0.01，圖4)。根據測序和RT-qPCR數據得到的轉錄水平是一致的，從而證實了測序信息是可靠的，以上結果初步表明 HO-1可作為診斷急性骨筋膜室綜合征的潛在分子標志物。

圖4 HO-1mRNA的相對表達倍數

3 討論

ACS被認為是一種骨科急癥，參與搶救的外科醫生應提高警惕，嚴格掌握筋膜切開術的適應證。面對患者的病史，應特別注意損傷機制，創傷病因分類是治療的關鍵。如果延誤診斷和治療，可能會導致肢體和生命危險的結局。因此，有必要進一步探索ACS的發生、發展機制及尋找可靠的診斷分子標志物。由于高通量測序技術的出現，生物信息學領域得以快速發展。多年來，它一直是生物醫學研究中不可或缺的一部分，大量的基因組學信息正在豐富積累，生物醫學研究的“大數據”時代已經到來[25,26]。然而，HO-1在ACS的發病機制中尚不完全清楚。為了深入了解HO-1在肌肉組織發病過程中相關作用方向，我們進行了測序分析。我們知道ACS的發生、發展與筋膜室內壓升高、缺血缺氧密切相關。本研究通過測序發現，ACS的肌肉組織中HO-1mRNA顯著上調，PCR證實了HO-1在轉錄水平高表達作為潛在診斷標志物這一結果，這使我們的研究更具說服力。

根據測序結果中GO富集條目可知，ACS中HO-1表達升高可能與防御反應和氧化應激等生物過程有關。在防御反應方面，具有保護作用的酶HO-1會廣泛參加機體組織的抗炎癥反應，并在早期發生效應[27]。在缺血缺氧條件下，它可以調控下級通路，使受損傷的臟器得以被保護。另外，發現了骨骼肌HO-1的新作用，是它穩定了缺氧誘導因子 -1α(Hypoxia-Inducible Factor-1α，HIF-1α)并促進了有效的葡萄糖利用，從而限制了缺血引起的組織壞死[9]。研究表明，HO-1可以保護骨骼肌免受損傷，而缺乏HO-1則會增加骨骼肌缺血時的細胞凋亡。HO-1可能被認為是限制肌肉損傷強度的一個因素[28]。外源性HO-1表達促進大鼠和小鼠后肢缺血模型中血流的恢復。肌肉生長可以通過HO-1介導的機制促進后肢缺血的血管生成。絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt1)介導的肌肉生長通過增強鄰近內皮細胞和巨噬細胞中HO-1的表達來促進缺血性病變中的血流恢復[8]。骨骼肌的特點是耗氧量高，因此具有抗氧化特性的酶在這種組織中被證明是有保護作用的[29]。在氧化應激方面，在HO-1活性強烈增強和血紅素大量供應的條件下，釋放大量的活性鐵，鐵離子通過與過氧化氫發生Fenton反應促進了氧自由基的產生，其中羥自由基最具有破壞性，其不僅能夠在體內與其鄰近的分子發生急速反應，同時還能夠促進與細胞的脂質成分發生過氧化生成大量脂質自由基，同時有大量ROS產生，導致細胞內穩態紊亂[30]，這就是鐵依賴性的脂質過氧化死亡即鐵死亡。一方面，Adedoyin等[31]認為：Erastin可以引起腎小管上皮細胞發生鐵離子依賴的脂質過氧化反應造成的組織細胞死亡，在這個過程中，HO-1可以抑制鐵死亡反應。Sun等證實，在Erastin處理的肝癌細胞中誘導HO-1對鐵死亡有保護作用[32]；而另一方面，Kwon等[33]認為在Erastin引起的成纖維肉瘤細胞發生鐵死亡過程中，HO-1抑制劑卻能夠減輕這種死亡程度，這側面說明了HO-1促進了鐵死亡反應，原因是HO-1產生的鐵會導致細胞內鐵過載。在鐵死亡過程中HO-1表達的這些不同的結果可能表明：HO-1在鐵死亡中的作用與所處環境和細胞類型相關。重要的是，不加控制的HO-1過度表達會導致嚴重的細胞毒性作用。因此，HO-1對骨骼肌細胞的效應可能與HO-1的表達量有關：輕中度表達表現為保護作用，高度表達導致壞死。通過控制該蛋白的表達來創造一個有益的閾值似乎是獲得治療效果的關鍵。另外，ROS是機體缺血性損傷中重要的引起因素[34]。ROS堆積過量，與不飽和脂肪酸作用從而引起過氧化反應。因此，降低ROS的量可以成為治療缺血性損傷的手段。這為后續的深入研究奠定了基礎。

綜上所述，HO-1mRNA在ACS中高表達，且與ACS 發生有一定相關性。因此，臨床上通過檢測肌肉組織中HO-1mRNA的表達，或許能夠作為一種早期輔助診斷ACS患者的新型分子標志物。本研究亦有不足之處，盡管通過測序發現了HO-1在ACS中潛在作用及價值，但PCR僅能提供基因在轉錄水平的驗證，這可能與蛋白水平的表達不完全一致。此外，HO-1在鐵死亡中的作用與所處環境和細胞類型相關，HO-1對骨骼肌細胞的效應可能與HO-1的表達程度有關，HO-1在ACS中導致骨骼肌壞死具體作用機制仍不明確，可能與鐵依賴性的脂質過氧化死亡，即鐵死亡有關，這一發現為進一步探討HO-1介導鐵死亡的分子機制提供了理論基礎。需要扎實的基礎研究來探索其參與ACS發生、發展的分子機制及相關信號通路。