基于網絡藥理學探討宣白承氣湯治療新型冠狀病毒肺炎的作用機制

豆文文，宋桂華，張巖，孫萌萌，張冰雪…，趙鄭琦

（1.河南中醫藥大學第一臨床醫學院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000）

0 引言

新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）簡稱新冠肺炎，是由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起的急性感染性疾病，臨床主要表現為發熱、乏力、干咳等癥狀，嚴重者可快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥、休克等[1]，因其傳染性強、人群普遍易感等特點，給社會和家庭帶來沉重的負擔。目前本病治療以廣譜抗病毒和對癥支持治療為主，尚缺乏特異性藥物[2]，在此背景下，中醫方案的制定與實施在疫情防治中發揮了積極作用，其縮短病程、防止病情惡化、促進肺炎康復等優勢逐漸被重視[3]。

宣白承氣湯出自《溫病條辨》，為吳鞠通所創八大承氣新方之一，由生石膏、生大黃、瓜蔞皮、杏仁4味藥物組成，具有宣肺通腑功效，是新冠肺炎常用方劑之一[4-5]，但由于中藥復方多成分、多靶點、多途徑及靶點之間相互作用的特點，使宣白承氣湯對COVID-19作用機制缺乏系統性及整體性研究，網絡藥理學的發展為此提供了契機。

網絡藥理學的概念由Andrew L Hopkins于2007年首次在Nature Biotechnology上撰文明確[6]，隨后將網絡藥理學作為“下一代藥物研發模式”進行闡述[7]，該研究策略的整體性、系統性特點與中醫學從整體的角度去診治疾病的理論，中藥及其方劑的多成分、多途徑、多靶點協同作用的原理殊途同歸[8]，因而迅速被應用于尋找中藥作用靶點、相關疾病藥理機制等相關領域的研究中。本研究通過網絡藥理學方法篩選宣白承氣湯的主要活性成分并以此為研究對象，探討其治療COVID-19的作用機制，為后續臨床及實驗提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 宣白承氣湯化學成分的收集及篩選

基于中藥系統藥理學數據庫和分析平臺[9]（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.ph）檢索杏仁、大黃的化學成分，篩選同時滿足ADME參數口服生物利用度（OB≧30%）和類藥性（DL≧0.18）的化學成分；通過中藥綜合數據庫[10]（TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid/）獲取石膏和瓜蔞皮的化學成分，保存化學成分的Canonical SMILES結構，對于數據庫無法提供SMILES結構的成分，通過ALOGPS2.1（http://www.vcclab.org/lab/alogps/）計算獲得，建立宣白承氣湯主要有效成分數據庫。

1.2 主要有效成分靶點預測

Swiss Target Prediction數 據 庫（http://www.swiss target prediction.ch/）基于已知配體的2D和3D相似性度量的組合來預測生物活性分子目標[11]，本研究通過該數據對瓜蔞皮、苦杏仁、大黃3味藥物的主要化學成分進行靶點預測，條件限定為 Homo sapiens，選取Probability>0的靶標結果，石膏的化學成分靶點通過DRAR-CPI數據庫（https://cpi.bio-x.cn/drar/）預測獲取，篩選Z-score<-0.5的靶標。由于檢索到的成分靶點存在命名不規范的情況，故將篩選所得靶點統一在Uniprot數據庫（http://www.uniprot.org/）進行校正和轉化，并以Swiss-Prot ID表示，去除重復項，建立宣白承氣湯4味中藥的靶點數據庫。

1.3 疾病靶點的獲得

以“novel coronavirus pneumonia”為 檢 索 詞，從 Gene Cards數 據 庫（https://www.genecards.org/） 及 OMIM 數 據庫（https://www.omim.org/）獲得新冠肺炎疾病的相關靶點，通過UniProt數據庫將疾病靶點Gene name校正為官方名稱，即Swiss-Prot ID，重復靶點僅保留1個，與1.2所得藥物預測靶點進行映射，通過在線軟件繪制韋恩圖（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），即得到宣白承氣湯治療新冠肺炎的預測靶點。

1.4 蛋白-蛋白相互作用網絡的構建及關鍵靶點篩選

將宣白承氣湯治療新冠肺炎的預測靶點導入STRING數據庫（https://string-db.org/），限定物種為 Homo sapiens，獲得蛋白相互作用數據TSV格式文件，導入Cytoscape3.2.1軟件繪制蛋白-蛋白相互作用網絡，并通過其Network Analysis功能計算拓撲參數，根據Degree值調整節點大小和顏色，篩選關鍵靶點。

1.5 生物過程與通路富集分析

為獲得宣白承氣湯治療新冠肺炎核心靶點的基因功能和主要作用通路，將共有靶點導入Cytoscape3.2.1的Clue GO插件進行基因本體論（gene ontology，GO）分析和KEGG通路富集分析，設置P≦0.01，獲取顯著性較高的生物過程和通路富集結果。

2 結果

2.1 宣白承氣湯活性成分篩選及靶點預測結果

TCMSP和TCMID數據庫共收錄宣白承氣湯化學成分215個，符合篩選條件的共有45個，其中苦杏仁19個、大黃16個、瓜蔞皮9個、石膏1個，將主要化學成分Canonical SMILES結構上傳至Swiss Target Prediction及DRAR-CPI數據庫進行靶點預測，并根據P值及Z-score值篩選、重復靶點保留1個，共得到預測靶點704個，主要化學成分及靶點數目見表1。

表1 宣白承氣湯中主要化學成分及靶點數目

2.2 宣白承氣湯治療新冠肺炎的預測靶點

通過GeneCards及OMIM數據庫分別獲得新冠肺炎相關靶點259個、90個，取交集去重后獲得新冠肺炎相關靶點333個，與2.1所得的704個預測靶點進行映射，獲得66個交集靶點，即宣白承氣湯治療新冠肺炎的可能靶點，見圖1。

圖1 藥物靶點與疾病靶點韋恩圖

2.3 蛋白相互作用網絡的構建及關鍵靶點篩選

將交集靶點通過STRING數據庫和Cytoscape3.2.1軟件繪制蛋白相互作用網絡及拓撲結構分析，共65個節點，平均Degree值18.369，見圖2，圖中節點表示靶蛋白，邊表示相互作用，節點的顏色和大小表示Degree值的大小，顏色由綠色到紅色、節點由小到大表示Degree值逐漸增大，可得到蛋白結合較高的靶點如白介素6（IL6）、表皮生長因子受體（EGFR）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、白介素4（IL4）等。宣白承氣湯治療新冠肺炎的66個靶蛋白中，65個靶蛋白與其他蛋白具有相互作用，與中藥復方靶點之間相互作用的特點相符。

圖2 宣白承氣湯蛋白PPI網絡

2.4 生物過程和通路分析

將宣白承氣湯與新冠肺炎共有靶點導入Cytoscape3.2.1的Clue GO插件，并根據P≤0.01篩選，獲得相關生物通路41條，主要涉及運動的正調節（positive regulation of locomotion）、活 性 氧 代 謝 過 程（reactive oxygen species metabolic process）、脂質修飾（lipid modification）、細胞對氧化應激的反應（cellular response to oxidative stress）等，見圖3。KEGG通路富集涉及糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、癌癥通路（Pathways in cancer）、原發性免疫缺陷（Primary immunodeficiency）、核 因 子 -κB信 號 通 路（NF-kappa B signaling pathway）等信號通路，見圖4。

圖3 宣白承氣湯治療新冠肺炎的GO生物過程

圖4 宣白承氣湯治療新冠肺炎的KEGG信號通路

3 討論

新冠肺炎屬于中醫學“疫”病范疇，疫毒犯肺，氣失宣降，肺津不布則痰涎壅滯，痰壅氣逆則喘促不寧，肺與大腸相表里，臟病及腑，陽明熱結則見大便秘結等癥狀。陽明腑實形成，疫邪有所依附，久戀不去，瘀閉肺絡及心包，從而出現呼吸困難、咯血等危急重癥，故治療上應宣肺通腑瀉熱，肺腸合治[12]。宣白承氣湯是中醫“肺與大腸相表里”臟腑相關理論指導下“肺腸同治”的代表方劑之一[13]，方中石膏清泄肺熱，瓜蔞皮、杏仁既可宣降肺氣，又可通過宣降肺氣助腑氣通調，治上即可治下，大黃雖重在邪熱通便，亦可通過瀉下助肺氣下行，四藥合用，上宣肺氣，下通地道，臟腑并調，在新冠肺炎的治療中發揮重要作用，但其效應機制尚不清楚，本研究通過網絡藥理學技術，依托生物信息學及多個數據庫初步探討宣白承氣湯治療新冠肺炎的主要活性成分、作用靶點及關鍵通路。

本研究經篩選獲取宣白承氣湯主要有效成分45個，可能是宣白承氣湯治療新冠肺炎的活性成分。新型冠狀病毒肺炎診療方案第七版中指出COVID-19患者可根據病情選擇抗病毒、抗菌、免疫支持等治療方案，抗艾滋病藥物洛匹那韋/利托那韋可用于COVID-19的治療,天花粉蛋白（trichosanthin）具有抗病毒、免疫調節等作用，趙巧云等[14]將人類免疫缺陷病毒1型在細胞系中培養, 加入天花粉蛋白后觀察細胞病變情況，發現天花粉蛋白在培養細胞系中可有效抑制人類免疫缺陷病毒1型。蘆薈大黃素、大黃素（Rhein）均具有抑菌、抗炎、免疫調節等多種藥理作用[15,16]，祁紅[17]通過動物實驗證實大黃素起效快,對炎癥早期的滲出、毛細血管通透性增高、白細胞游走等有較好的對抗作用, 對急性炎癥有明顯對抗作用。新冠肺炎部分患者在疾病發展過程中因炎癥風暴的發生而出現免疫紊亂，研究發現[18]，新冠肺炎患者血清中IL-2、IL-6、TNF-α等多種細胞因子水平升高，蘆薈大黃素可通過抑制IL-2誘發的T細胞增殖發揮免疫調節作用[19]，亦可降低血清中PAF、IL-6和TNF-α水平發揮抗炎作用[20]。β-谷甾醇（beta-sitosterol）和豆甾醇（Stigmasterol）均具有抗炎活性，β-谷甾醇可通過減少NO的合成，抑制巨噬細胞IL- 6活性，減少IL-1、TNF-α等炎性因子的分泌發揮抗炎作用[21]，豆甾醇能明顯抑制LPS誘導的環氧合酶-2、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA和蛋白水平的提高，抑制前列腺素E2（PGE2）和一氧化氮(NO)的釋放發揮抗炎作用[22]。綜上，宣白承氣湯中有效成分可能通過抗病毒、抗炎、抗菌、免疫調節等途徑發揮治療新冠肺炎的作用。

宣白承氣湯治療新冠肺炎的靶點共66個，通過STRING數據庫我們獲得蛋白結合度較高的靶點如IL-6、EGFR、CASP3、MAPK1、MAPK3、MAPK8。急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是新冠肺炎病情進展的嚴重并發癥之一，ARDS死亡組患者血清中IL-6水平顯著升高[23-24]，故推測IL-6參與ARDS的發病過程，有研究表明[25]，在西醫常規治療基礎上配合宣白承氣湯有助于改善患者的呼吸功能和呼吸力學參數，其機制可能與減輕全身炎癥反應有關。此外，尚俊等[26]研究發現宣白承氣湯佐治ALI/ARDS的療效優于單純西醫治療，可有效降低患者血清中CRP、IL-6、TNF-α和內毒素水平的水平。表皮生長因子受體（EGFR）是一種酪氨酸激酶受體，研究發現抑制EGFR活化能降低病毒的感染滴度[27]。Caspases 作為一類蛋白裂解酶，可被許多促凋亡因子（如細菌病毒感染、發熱或氧自由基等）所活化，半胱氨酸蛋白酶-3（CASP3）為最主要的凋亡調節因子[28]，炎性介質阻斷劑可有效抑制CASP3的表達，減少凋亡細胞數量[29]。MAPK1、MAPK3、MAPK8為絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員，活化的MAPK可通過磷酸化核轉錄因子、細胞骨架蛋白及酶類等參與細胞增殖、分化、轉化及凋亡的調節，并與炎癥、腫瘤等多種疾病的發生密切相關[30]。

生物過程GO分析和KEGG信號通路分析結果顯示，宣白承氣湯可能通過多通路發揮治療新冠肺炎的作用。活性氧代謝過程為富集程度較高的生物過程之一，活性氧在肺損傷中一方面可促進黏蛋白的分泌，另一方面可起到炎癥反饋放大環和損傷血管內皮作用[31]，研究證實在急性肺損傷中肺內大量聚集在中性粒細胞，肺泡巨噬細胞內NF-κB被激活，采用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽等可抑制NF-κB的活化，同時也明顯改善肺部炎性損傷程度[32]。此外，NF-κB參與介導免疫應答、病毒復制等過程，在調節炎癥反應相關基因中起關鍵作用，研究發現[33]，重癥肺炎的病理生理學涉及復雜的細胞因子和炎癥介質網絡，NF-κB是導致網絡激活、促進重癥肺炎發展的中樞，通過阻斷NF-κB途徑可改善其異常的病理生理及預后。

綜上，本研究基于網絡藥理學技術對宣白承氣湯治療新型冠狀病毒肺炎的活性成分、靶點及作用機制進行了初步探討，但由于該研究數據均來源于已有的數據庫資源，且缺乏實驗支持，后期可通過動物實驗及實驗室檢測進一步探索與驗證。