天天膠囊對免疫抑制小鼠的免疫增強作用研究

忽萌萌，栗田，夏建偉，張東建，張健，殷志琦

（1.中國藥科大學中藥學院中藥制劑系&天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009；2.江蘇省中醫藥研究院轉化醫學實驗室，江蘇 南京 210028；3.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院，江蘇 南京 210028）

0 引言

免疫系統是一個由淋巴器官、細胞、體液因子和細胞因子共同組成的互動網絡，其通過特異性免疫和非特異性免疫協同作用，識別、排斥并清除病原體和其他外來抗原，維持宿主的健康[1]。研究證明，免疫抑制的人群較正常人群更易感染流感病毒，感染后常出現嚴重并發癥甚至死亡[2-3]。

腸道粘液是抵御共生微生物和入侵病原體的一道重要防線[4]。粘液中含有多種免疫調節分子，在十二指腸和回腸腔內的粘液存在較高濃度的免疫球蛋白A(IgA)，小腸隱窩層的底部亦可產生一些抗菌物質，如：防御肽，溶酶菌等。此外，腸道免疫功能還與腸道中負責分泌粘液的杯狀細胞間存在密切聯系[5]。一方面，免疫系統可通過免疫因子調節杯狀細胞的功能。例如，輔助型T細胞2(Th2)通過產生IL-4，IL-5，IL-9和IL-13促進杯狀細胞增生和粘液分泌[6-7]。另一方面，小腸杯狀細胞分泌粘液時能夠感知腸腔內的抗原物質，并且能夠將抗原從腔內傳遞到固有層的樹突狀細胞中，通過與T細胞相互作用進而觸發免疫響應[8]。因此，刺激粘液分泌，促進杯狀細胞增生將有益于提高機體的免疫水平。

天天膠囊(TTC)是由蘆薈、南瓜、低聚木糖、茯苓和銀耳組成具有通便作用的保健食品。本課題組在前期的通便機制研究中發現TTC能夠促進杯狀細胞的增生及粘液的分泌[9]，因此，我們推測TTC可能有增強機體的腸道免疫和全身免疫的功能。為驗證這一假設，本研究使用腹腔注射環磷酰胺(CPM)構建的免疫抑制小鼠模型，評價TTC對免疫功能的調節作用，為拓展天天膠囊的功效及適應證提供依據。

1 材料

1.1 藥品與試劑

天天膠囊(河北御芝林藥業有限公司，批號：20180923)；鹽酸左旋咪唑(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：20190920)；環磷酰胺(上海阿拉丁試劑有限公司，批號：20190620)；印度墨汁(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：20191019)；刀豆蛋白 A(北京 Coolaber公司，批號：20191023)；胎牛血清(美國Sigma公司)；LPS(江蘇凱基生物技術有限公司，批號：20180120)；1640培養基(江蘇凱基生物技術有限公司，批號：20190722)；DMSO(北京索萊寶技術有限公司，批號：20190820)；小鼠 INF-γ、IL-6和 IL-2 ELISA 試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：20191021)；INF-α（武漢伊萊瑞特有限公司，批號20191021）；IL-1β和分泌型免疫球蛋白A ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特有限公司，批號：20191025)；CD4-FITC單克隆抗體（美國biogems公司，批號：#AF6998）；CD8-PE單克隆抗體(美國biogems公司，批號：#NBP1-97927)。

1.2 儀器

電子天平(美國Mettler Tolerdo公司，型號：MS206DU)；全波長多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司，型號：SynergyH1)；超速控溫離心機(美國Beckman Coulter公司，型號：Allera64R)；熒光倒置顯微鏡(德國Carl Zeiss公司，型號：164-5052)；流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3 實驗動物

昆明小鼠，SPF級，雌雄各半，體重（21±2）g，共 72只，購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司，生產許可證號為[SCXK(滬)2017-0005]。動物喂養于江蘇省中西醫結合醫院動物實驗中心，飼養于溫度24℃-26℃，相對濕度40%~60%，12 h光照和12 h黑暗交替的環境中，期間正常飲食、飲水。本研究的動物和實驗方案均已獲江蘇省中醫藥研究所倫理委員會批準。

2 實驗方法

2.1 動物分組、造模和治療

小鼠適應性飼養一周后，將其隨機分為6組，每組12只：正常對照(NC)組、模型對照(MC)組、陽性藥鹽酸左旋咪唑(LM, 20 mg/(kg·d))治療組、天天膠囊低劑量[LTTC, 8.3 mg/(kg·d)]治療組、天天膠囊中劑量 [MTTC, 16.5 mg/(kg·d)]治療組和天天膠囊高劑量[HTTC, 33.0 mg/(kg·d)]治療組。

模型組和治療組腹腔注射環磷酰胺（CPM）80mg/kg·d，構建小鼠的免疫抑制模型；空白對照組腹腔注射同體積無菌生理鹽水。CPM注射3d后，治療組灌胃給藥治療7d，空白和模型組灌胃給予同體積的0.3%CMC-Na溶液。其中，每組隨機選取3只小鼠用于檢測吞噬指數，3只小鼠用于淋巴細胞增殖實驗。

2.2 TTC對免疫抑制小鼠單核巨噬細胞碳粒廓清指數和吞噬指數的影響

每組隨機選取的3只小鼠于末次給藥24 h后，尾靜脈注射體積分數25%的印度墨汁(10 mL/kg)，并于2 min、10 min后分別于眼球后靜脈叢取血20 μL，立即將其吹入2 mL質量分數為1 %的Na2CO3溶液中，搖勻，在波長675 nm處測定OD值。

按下列公式計算碳粒廓清指數(K)和吞噬指數(α)。

K=(LgA1-LgA2)/(t2-t1)

α=K1/3×W/WLS

式中，A為血樣吸光值(A1，A2為2次測定吸光值)；t為采血時間(t1，t2為2次采血時間)；W為體重；WLS為肝脾合重。

2.3 TTC對免疫抑制小鼠免疫器官的影響

每組隨機選取6只小鼠，摘眼球取血，采血結束后，處死小鼠，取出脾臟和胸腺，精密稱量，計算出小鼠的脾臟和胸腺指數。

脾臟指數=脾臟重量(mg)/小鼠體重(g)

胸腺指數=胸腺重量(mg)/小鼠體重(g)

2.4 TTC對免疫抑制小鼠T淋巴細胞亞群的影響

將“2.3”收集的血液，每組隨機選取3只，分別與CD4-FITC和CD8-PE混合，在4℃條件下避光染色30min，各管加入紅細胞裂解液1mL，混勻，避光10min，然后加入PBS溶液1mL混勻，1000r/min離心10min，棄上清。使用500μL的PBS重懸細胞沉淀，通過流式細胞儀檢測CD4+和CD8+T淋巴細胞的百分率。

2.5 血清抗體IgG和IgM檢測

為評價藥物對小鼠特異性體液免疫的影響，取“2.3”中獲得的血液，分離得到的各組小鼠血清，每組隨機選取3只，按照ELISA試劑盒說明書檢測藥物對小鼠血清IgG和IgM的含量。

2.6 TTC對免疫抑制小鼠脾臟淋巴細胞增殖的影響

2.6.1 脾細胞懸液制備

每組隨機選取3只空白小鼠，脫頸處死，置于75%酒精中浸泡30s，超凈工作臺中快速剝離脾臟，加預冷PBS清洗2次，加入3mL1640培養基冰浴勻漿，200目篩子過濾，濾液以1500r/min離心5min，棄上清，加入紅細胞裂解液3mL，冰上孵育10min，1500r/min離心5min，棄上清。加預冷PBS漂洗2次，最后加入3mL1640完全培養液重懸，進行細胞計數和鋪板。

2.6.2 TTC以及TTC協同ConA、LPS對小鼠淋巴細胞增殖的影響

取“2.6.1”制備的各組脾細胞懸液分為3組分別以2×105cells/mL的密度接種于96孔板，每孔100μL細胞懸液。第1組為空白組用1640完全培養液培養，第2組用含有8μg/mLConA的培養液培養，第3組用含有20μg/mLLPS的培養液培養。培養箱孵育48h后，每孔加10μLMTT，繼續孵育4h，孵育結束后，用注射器吸取96孔板內的培養基，每孔加入150μL的DMSO溶液，置搖床上震搖10min，于490nm波長處測定吸光度值，結果以三個復孔A值表示。

2.7 TTC協同ConA對小鼠脾淋巴細胞分泌細胞因子的影響

取“2.6.1”制備的脾細胞懸液以3×105cells/mL的密度接種于在6孔板中，每孔2 mL細胞懸液。將其分為6個組，分別為NC組、MC組、LM組、LTTC+ConA組、MTTC+ConA組和HTTC+ConA組，ConA的終濃度為8μg/mL。將細胞置于培養箱中培養72h后，離心收集上清，ELISA法檢測上清液中細胞因子水平。

2.8 TTC對免疫抑制小鼠空腸組織損傷的影響

每組選取3只小鼠剪取適量的空腸組織，預冷的PBS緩沖液沖洗，使用組織勻漿器在冰浴狀態下勻漿，離心后吸取上清，根據ELISA試劑盒說明書檢測空腸組織中sIgA、INF-α、IL-1β的含量。另取部分組織進行HE染色，用倒置顯微鏡觀察空腸組織的黏膜結構。

2.9 統計分析

數據以均值±標準差(Mean±SEM)表示，用Prism 7.0統計軟件進行統計，多組間比較采用單因素方差分析(oneway ANOVA)，兩組間的多重比較采用LSD法，P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 TTC對免疫抑制小鼠單核巨噬細胞碳粒廓清指數和吞噬指數的影響

本文采用體內碳粒廓清試驗分析TTC對免疫抑制小鼠單核吞噬系統功能的影響。結果如Table 1所示，MC組小鼠血液碳粒廓清指數和吞噬指數顯著低于NC組；而經LM和TTC治療一周后，LM組和TTC各劑量組的碳粒廓清指數和吞噬指數顯著高于MC組，且差異具有統計學意義(P<0.05)。結果提示，TTC可增加免疫抑制小鼠的非特異性免疫功能。

Table 1 Effect of TTC on the phagocytic activity of the mononuclear phagocytic system in mice(±s,n=3)

Table 1 Effect of TTC on the phagocytic activity of the mononuclear phagocytic system in mice(±s,n=3)

NC: normal control group; MC: model control group; LM:levamisole hydrochloride treatment group; LTTC: low dose of TTC;MTTC: middle dose of TTC; HTTC: high dose of TTC.Data are expressed as mean±SEM.#P<0.05,##P<0.01,compared to the NC.*P<0.05,**P<0.01,compared to the MC.

組別 碳粒廓清指數 (K) 吞噬指數 (α)NC 0.07081±0.0144 8.8163±0.7560 MC 0.01782±0.0097## 4.3597±1.0454##LM 0.04939±0.0051*# 6.3508±0.6014*#LTTC 0.04027±0.0247*# 5.1436±1.9815##MTTC 0.06259±0.0087*# 6.9701±0.3720*#HTTC 0.07187±0.0067* 7.2261±0.2218**#

3.2 TTC對免疫抑制小鼠免疫器官的影響

分析免疫器官指數發現，相較于NC組，MC組小鼠的脾臟指數和胸腺指數顯著降低(P<0.05)；而與MC組相比，LM組和TTC各組的胸腺指數顯著增加(P<0.05)。脾臟指數呈增長趨勢(P>0.05)，差異無統計學意義。見Table 2。

Table 2 Effect of TTC on thymus and spleen indices of mice(±s, n=6)

Table 2 Effect of TTC on thymus and spleen indices of mice(±s, n=6)

Data are expressed as mean±SEM.#P<0.05,compared to the NC.*P<0.05 and *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,compared to the MC.ns:P>0.05

Group Thymus index(mg/g) Spleen index(mg/g)NC 7.3905±0.3512 2.1638±0.2483 MC 4.5402±0.7707# 1.5677±0.3691(ns)LM 8.7914±0.5433*** 1.7609±0.4679(ns)LTTC 7.1933±0.5600* 1.8195±0.2729(ns)MTTC 7.7145±0.6633** 2.0513±0.3646(ns)HTTC 7.3186±0.38267* 1.7727±0.3572(ns)

3.3 TTC對免疫抑制小鼠血清抗體IgG和IgM的影響

如Fig.1所示，MC組小鼠血清中IgG和IgM的含量相較于NC組均顯著降低(P<0.05)，而相比于MC組，不同劑量的TTC均可提高IgG和IgM的含量(P<0.05)，且MTTC組的效果最好。提示，TTC可調節機體的體液免疫功能。

Fig.1 Effects of TTC on the levels of serum immunoglobulin in mice(±s,n=3).

3.4 TTC對免疫抑制小鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響

研究報道，CD4+和CD8+是T細胞的兩大亞型，而機體CD4+和CD8+的比值是反應機體免疫水平的重要指標[10]。如Fig.2A和2B所示，與NC組相比，MC組外周血中CD4+和CD8+百分率含量顯著降低(P<0.05)。給予不同劑量天天膠囊和陽性藥治療后，相比于MC組，各治療組的CD4+和CD8+百分率均顯著升高(P<0.05)，其中MTTC組的CD4+增加尤為顯著(P<0.001)；且CD4+與CD8+的比值在MTTC組也有升高的趨勢（Fig.2C）(P>0.05)，差異無統計學意義。上述結果說明，TTC可調節機體的細胞免疫。

3.5 TTC對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖和細胞因子的影響

如Fig.3A所示，TTC治療組能顯著刺激脾細胞的增殖(P<0.05)。進一步用ConA和LPS分別刺激脾細胞時，結果顯示，與MC組相比，TTC與ConA合用時，T淋巴細胞增殖水平升高，且中劑量與模型組相比差異有統計學意義(P<0.01)。與T淋巴細胞的結果類似，當TTC與LPS共同作用時，與MC組相比，低劑量和高劑量中的B淋巴細胞增殖水平也被顯著提高(P<0.05)。上述數據表明：TTC能促進環磷酰胺損傷的免疫抑制鼠的脾細胞的增殖。同時，TTC能協同ConA和LPS分別刺激T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖。

如Fig.3B-D所示，與NC組相比，MC組脾淋巴細胞上清液中IL-2、IL-6和INF-γ含量均顯著降低(P<0.05)，而TTC可顯著提高INF-γ、IL-6和IL-2的含量(P<0.05)，且MTTC的效果最佳。提示：TTC可改善CPM誘導的脾淋巴細胞功能紊亂。

3.6 TTC對免疫抑制小鼠空腸組織的影響

如Fig.4A所示，NC組腸黏膜層次分明，腸絨毛形態規則，分布均勻，固有層結構清晰，其內細胞整齊排列。相較與NC組，MC組可見腸黏膜上皮大量壞死和脫落，空腸絨毛斷裂，形狀不規則，黏膜層結構混亂，隱窩深度顯著下降，杯狀細胞數量顯著降低。給予LM和TTC治療一周后，LM組的腸黏膜排列整齊且完整，絨毛長度明顯增長，杯狀細胞增多；TTC各組黏膜相對完整，未見明顯脫落，杯狀細胞顯著增多，絨毛長度增長。結果提示，TTC可以治療CPM誘導的小鼠腸道損傷。

空腸組織中細胞因子水平可直接反映腸道黏膜免疫情況，如Fig.4B-D所示，與NC組相比，MC組小鼠空腸組織sIgA、IL-1β和INF-α含量均顯著降低(P<0.05)；與MC組相比，不同劑量的TTC組小鼠空腸組織sIgA、IL-1β和INF-α含量均顯著增高(P<0.05)。提示，TTC可調節腸道黏膜免疫。

Fig.4 Effects of TTC on jejunum in mice(±s,n=3)

Fig.2Effect of TTC on T lymphocytes in mice(±s, n=3)

Fig.3Effects of TTC on spleen lymphocyte proliferation and cytokine induction of spleen lymphocyte in mice(±s,n=3)

4 討論

本研究使用CPM建立的免疫抑制小鼠模型，探究TTC對機體是否有免疫調節作用。研究結果顯示，TTC能增強免疫抑制小鼠的腸道黏膜免疫反應。進一步研究發現，TTC也可提高免疫抑制小鼠機體的特異性和非特異性反應，表現出良好的免疫增強作用。

黏膜免疫系統是獨立于系統免疫的特殊免疫體系，其可耐受性食物抗原和共生菌，但對病原微生物具有免疫應答效應。腸黏膜是大多數免疫過程發生的部位[11-12]。粘液作為機體腸黏膜免疫的第一道防線，可阻止細菌對腸上皮細胞的侵襲。已有研究報道，維生素A作為一種免疫增強劑能促使粘液分泌[13]。因此，促進粘液分泌，維持腸道粘液完整性可有益于提高機體的腸黏膜免疫。本課題組的前期研究發現，TTC在通便過程中可顯著刺激腸道粘液的分泌。提示，TTC可具有增強機體腸黏膜免疫的作用。已知分泌型免疫球蛋白A(sIgA)廣泛分布于粘液中，是腸黏膜免疫的主要體液介質[14]。研究發現仿刺參和靈芝多糖均可通過增加sIgA分泌增強腸黏膜免疫水平[15-16]。本文研究顯示，經TTC治療后，免疫抑制小鼠的sIgA的水平顯著增加，說明TTC具有改善免疫抑制小鼠腸黏膜免疫的作用。此外，TTC還可顯著上調空腸組織IL-1β和INF-α的水平，而IL-1β在先天性免疫應答調控中起著重要作用，INF-α參與T淋巴細胞的活化。此結果與黑靈芝多糖改善免疫抑制小鼠腸道免疫的結果相似[17]。此外，TTC還可逆轉CPM誘導的空腸組織損傷。綜上可知，TTC可以改善CPM損傷的腸黏膜機械屏障，增強其腸黏膜免疫功能。

吞噬細胞是先天免疫反應的重要參與者，單核巨噬細胞吞噬指數常被用來評估機體非特異性免疫狀態[18]。在本研究中，TTC可顯著提高CPM小鼠的吞噬指數，提示TTC具有增強機體的非特異性免疫的作用。T細胞被認為是調節細胞免疫的主要免疫細胞，主要分為CD4差異有統計學意義T和CD8差異有統計學意義T細胞兩大類型[19-20]。當CD4差異有統計學意義與CD8差異有統計學意義的比值較高時，表明機體處于較高的免疫應答水平[10]。本研究發現，MTTC能顯著提高免疫抑制小鼠外周血的CD4差異有統計學意義與CD8差異有統計學意義的比值，說明TTC可提高免疫抑制小鼠的細胞免疫功能。免疫球蛋白是由B細胞分泌的參與全身體液免疫的一類球蛋白，其通過特異性結合病原體和中和毒素，使病原體更易被吞噬細胞所吞噬、清除[21]。本實驗結果顯示，TTC能顯著提高免疫抑制小鼠血清中的IgM和IgG的水平，提示TTC可增強免疫抑制小鼠的體液免疫功能。上述結果說明，TTC可顯著提高免疫抑制小鼠系統的特異性和非特異性免疫功能。

脾臟作為重要的免疫器官，在機體的免疫功能調節中扮演重要的角色。脾細胞增殖是活化特異性免疫系統的一個重要過程[22-23]。本研究顯示，TTC能夠顯著增加免疫抑制小鼠的脾臟指數，促進免疫抑制小鼠T、B淋巴細胞的增殖，同時顯著增加脾細胞中IL-2、IL-6和IFN-γ的分泌。這些結果表明，TTC能改善CPM誘導的脾細胞功能紊亂。

綜上，TTC可通過增強免疫抑制小鼠的腸黏膜免疫，改善機體的非特異性和特異性免疫反應，進而發揮其免疫增強的作用，為天天膠囊作為免疫增強劑的開發提供依據。但天天膠囊增強機體免疫的機制尚不明確，仍需進一步深入探究。