小鼠肺間充質干細胞的分離、培養和鑒定

2021-09-15 01:12:06石桂英黃藝瀅雷雪裴路亞嵐白

中國比較醫學雜志 2021年8期

石桂英黃藝瀅雷雪裴路亞嵐白琳

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所,北京協和醫學院比較醫學中心,國家衛生健康委員會人類疾病比較醫學重點實驗室,國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,北京 100021)

間充質干細胞是一群能夠形成克隆的成纖維樣細胞。國際細胞和基因治療學會(International Society for Cell & Gene Therapy,ISCT)對間充質干細胞的分類標準是:高表達CD73、CD90和CD105,不表達血液細胞標記如CD34、CD45、CD11b等[1]。間充質干細胞在組織再生修復、免疫調節等方面具有重要作用,在各組織器官中都有組織特異性的間充質干細胞[2]。肺作為多種動物的呼吸器官,機體通過肺與外界環境進行氣體交換,各種有害物質如化學氧化劑、蛋白酶、病毒、細菌等都可造成肺損傷。盡管存在眾多因素會導致肺損傷,但正常個體仍能保持正常的肺功能,這說明肺部具有強大的損傷修復和再生能力[3]。肺間充質干細胞(lung-resident mesenchymal stem cell,lr-MSC)首先是在肺灌洗液中發現的,2014年Rolandsson等[4]在支氣管壁和肺實質的血管周組織中分離出lr-MSC,證實了lr-MSC的位置和表型等特征。與骨髓間充質干細胞相比,lr-MSC表達相似的表面蛋白,在轉錄組、蛋白質組和分泌組學等方面均有所不同[5-6],其在肺生理和病理過程中的作用,以及在治療肺部疾病中的應用前景,還有待深入研究[2]。

本項目從C57BL/6J小鼠中利用兩種方法分離培養了lr-MSC,對其的形態、生長特性、表面標記物及多向分化能力進行分析,發現lr-MSC為成纖維樣細胞,表達Sca-1、CD90、CD29、CD44等干細胞表面標記,不表達血管內皮標記CD31和白細胞表面標記CD45,具有成脂、成骨分化能力。lr-MSC的分離、培養和鑒定可以為研究lr-MSC的功能提供體外模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級C57小鼠6只,體重18~22 g,4周齡,雌雄各半,購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2020-0004],實驗操作在研究所解剖室進行[SYXK(京)2019-0014],實驗方案經本研究所實驗動物使用與管理委員會審批(BL17002),實驗中按實驗動物使用的3R原則執行。

1.2 主要試劑與儀器

細胞培養用胎牛血清(批號:1908360C)、α-MEM(批號:2120408)、DPBS(批號:2120391)、青鏈霉素(批號:2076677)、胰酶(批號:2062475)、流式抗體等均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;組織消化用Ⅰ型膠原酶(批號:9001-12-1)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;成骨(批號:191002G001、成脂(批號:191107G001)誘導培養液均購自賽業(蘇州)生物科技有限公司;流式細胞儀為AriaⅡ,購自美國Becton Dickinson公司;CO2培養箱購自美國Thermo公司;倒置熒光顯微鏡購自德國Leica公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肺間充質干細胞的分離培養

脫頸椎處死小鼠,75%乙醇浸泡消毒后,置于超凈臺上,無菌條件下分離肺組織,用PBS沖洗干凈,剪成1 mm3小組織塊,一半加入α-MEM完全培養基(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素)直接接種6孔板,37℃,5% CO2培養,每3 d換液,細胞從組織塊爬出融合達80%左右時,胰酶消化細胞進行傳代,同時去除組織塊;另一半加入等體積0.1%膠原酶Ⅰ,37℃振蕩消化2 h,加入等體積PBS后離心,1500 r/min,5 min,棄上清,加入2 mL α-MEM完全培養基,經70 μm細胞篩過濾,計數,接種到6孔板,106細胞/孔,37℃,5% CO2培養。24 h后換液,此后每3 d換液,細胞融合達80%左右時,進行傳代。

1.3.2 生長曲線測定

取第3代生長狀態良好的細胞,接種24孔板,104個/孔。自接種后第2天起,每隔48 h取3孔消化計數,記錄細胞數,繪制生長曲線。

1.3.3 流式細胞術檢測干細胞比例

取第3代生長狀態良好的細胞,胰酶消化收集細胞,計數,離心,1500 r/min,5 min,棄上清,加入適量PBS,調整細胞濃度為107/mL,取106細胞加入流式抗體,進行染色,4℃,30 min。染色抗體為:CD31-FITC,CD90-FITC,CD29-PE,CD45-PE,Sca-1-PE-cy7,CD44-APC-cy7。

1.3.4 誘導成脂

取第3代生長狀態良好的細胞,接種24孔板,104個/孔,37℃,5% CO2培養,當細胞融合達80%以上時,吸棄培養基,加入2 mL成脂誘導培養基,之后每3 d換液,誘導21 d左右,觀察細胞變化,對照組加α-MEM完全培養基。成脂鑒定采用油紅O染色:吸棄誘導培養基,加PBS洗2次;加4%多聚甲醛固定30 min;吸棄多聚甲醛固定液,加入60%異丙醇洗2次;加入油紅O染色液,染色60 min;吸棄染色液,加PBS洗3次,倒置顯微鏡觀察、拍照。

1.3.5 誘導成骨

取第3代生長狀態良好的細胞,接種24孔板,104個/孔,37℃,5% CO2培養,當細胞融合達60%~80%時,吸棄培養基,加入2 mL成骨誘導培養基,之后每3 d換液,誘導21 d左右。成骨鑒定采用茜素紅染色:吸棄誘導培養基,加PBS洗2次;加4%多聚甲醛固定30 min;吸棄多聚甲醛固定液,加茜素紅染色液,染色5 min;吸棄染色液,加PBS洗3次,倒置顯微鏡觀察、拍照。

1.4 統計學方法

數據統計分析采用GraphPad Prism 6軟件,結果用平均數±標準差(ˉx±s)表示,組間比較用t檢驗,P<0.05,認為差異顯著,有統計學意義。

2 結果

2.1 生長特性

本實驗采用膠原酶消化和肺組織塊直接培養兩種方法分離lr-MSC。膠原酶消化法,在接種后第2天即可見細胞貼壁,之后迅速擴增;而組織塊培養法,細胞貼壁較慢,第4天時可見細胞貼壁(圖1)。兩種方法分離的細胞傳代至第三代時,細胞均為成纖維樣形態,傳代時間基本一致(圖2)。

注:上行為肺組織經膠原酶Ⅰ消化后細胞貼壁生長狀態,從左到右依次為培養2、5、8 d的細胞;下行為肺組織直接培養的細胞貼壁生長狀態,從左到右依次為培養2、5、8 d的細胞。圖1 原代肺間充質干細胞的貼壁生長狀態Note.Upper line shows the status of cell adherent growth after collagenaseⅠdigestion,from left to right,the culture day is 2,5,8 days.Next line shows the status of cell adherent growth with lung tissues,from left to right,the culture day is 2,5,8 days.Figure 1 Lung mesenchymal stromal cells

注:A:細胞形態;B:生長曲線。圖2 肺間充質干細胞的形態和生長曲線Note.A,Cell morphology.B,Growth curve.Figure 2 Morphology and growth curve of lung mesenchymal stromal cells

2.2 干細胞比例

取第三代細胞標記間充質干細胞表面標記物,陰性標記物CD45、CD31均為低表達,陽性標記物Sca-1、CD90、CD29、CD44的表達量均在90%以上(圖3)。從細胞表面標記物表達來看,所得細胞符合干細胞特性。

圖3 肺間充質干細胞的表面標記流式分析Figure 3 FACS results for the surface markers of lung mesenchymal stromal cells

2.3 誘導成脂能力

為檢測lr-MSC的成脂分化能力,取第三代細胞接種至24孔板,成脂誘導液誘導21 d后,油紅O染色,可見細胞內有紅色脂滴,但仍有部分細胞未分化為脂肪細胞(圖4)。

2.4 誘導成骨能力

為檢測lr-MSC的成骨分化能力,取第三代細胞接種至24孔板,成骨誘導液誘導21 d后,茜素紅染色,可見鈣鹽沉積著紅色(圖5)。

3 討論

作為機體與外環境進行氣體交換的器官,肺組織結構復雜,構成細胞較多,包括多種上皮細胞、內皮細胞和間充質細胞等[7]。Hegab等[8]分離了lr-MSC,發現這些細胞表型為Sca1+CD45-CD31-,體外培養時能夠自我更新,并能分化成內皮細胞、肺泡上皮細胞等,同時還具有間充質干細胞的特性;將lr-MSC移植到肺損傷小鼠模型中,可以提高小鼠的生存率,減少肺損傷。已有研究表明,lr-MSC是肺組織修復和再生的重要調節因子,特發性肺纖維化是由lr-MSC分化為成肌細胞所導致的[9-10]。本研究采用膠原酶消化和肺組織塊直接培養兩種方法分離lr-MSC。膠原酶消化法,細胞貼壁快,可在較短時間內獲得大量細胞;而組織塊培養法,細胞貼壁較慢,第4天時可見細胞貼壁。在之后的傳代過程中,兩種方法分離所得細胞的增殖速度基本一致。本研究兩種方法分離的細胞表型無差別,與Hegab等[8]分離的細胞表型一致,表現為Sca1+CD45-CD31-CD90+CD29+CD44+。在分化能力方面,本研究進行了成脂和成骨誘導分化,誘導21 d后分別形成了脂滴和鈣鹽沉積,可見所得lr-MSC具有多向分化能力。在誘導21 d后仍有部分細胞未分化,這可能與誘導液的誘導效率、誘導時間,以及lr-MSC細胞組成等有關,在后續研究中將調整誘導液各組分的濃度、延長誘導時間以提高誘導效率,同時分析lr-MSC多種表面標記,以深入了解lr-MSC的細胞組成情況。