四君子湯含藥血清通過抑制RhoA/Rac1/Cdc42通路影響卵巢癌細胞的上皮間質轉化

李 凡張學林馮靜茹郝 潔周 蕾

(河北北方學院附屬第二醫院,張家口 075100)

卵巢癌(ovarian cancer,OC)是全球第六大常見的女性婦科疾病,死亡率居婦科惡性腫瘤之首[1-2]。由于OC患者發作時具有隱匿性,因此確診時70%處于晚期,為提高OC患者的生存率增加了挑戰,因此開發新型有效藥物改善OC治療效果是當務之急[3]。四君子湯由人參、白術、茯苓和炙甘草四味中藥材組成,對脾胃氣虛、調節腸道蠕動和促進消化等具有良好的治療效果[4]。此外,朱超等[5]研究發現,四君子湯能夠抑制胃癌細胞株側群細胞的增殖和侵襲能力。Ras同源基因家族成員A(Ras homolog gene family member A,RhoA)、Ras相關的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)和細胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42,Cdc42)與細胞遷移和侵襲密切相關,已被證實阻斷RhoA/Rac1/Cdc42信號途徑,能夠抑制風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞的遷移和侵襲行為,但四君子湯對卵巢癌遷移和侵襲的影響及其具體作用機制尚不明確[6]。本實驗旨在探索四君子湯含藥血清對人卵巢癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響,并初步研究其與RhoA/Rac1/Cdc42信號通路的關聯,為OC的臨床治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠50只,8周齡,體重(200±20)g,均為雌性,購自上海劍鈍生物科技有限公司[SCXK(滬)2019-0027],動物飼養于河北北方學院(藥學系)[SYXK(冀)2019-004]。本研究經河北北方學院附屬第二醫院倫理委員會批準(倫審IACUC2019-0307號),實驗符合3R保護原則。

1.1.2 細胞

人卵巢癌細胞SKOV3購自中國科學院細胞庫,批號TCHu185;人卵巢上皮細胞購自北京北納創聯生物技術研究院,批號BNCC340096。

1.2 主要試劑與儀器

四君子湯顆粒(人參12 g,白術12 g,茯苓12 g,炙甘草6 g)由本院中藥房提供;舒尼替尼(原料藥,純度≥98%,批號20190109)購自武漢貝爾卡生物醫藥有限公司;McCOY’s 5A培養基(批號M9420)、RPMI 1640培養基(批號31800022)、噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑(批號M8180)、Matrigel膠(批號356234)、RIPA裂解液(批號R0010)、ECL發光液(批號PE0010)、TRIzol試劑盒(批號15596-018)、逆轉錄試劑盒(批號T2210-200T)、無血清培養基(批號ML4011)均購自北京Solarbio公司;胎牛血清(批號C0225)、胰酶消化液(批號C0201)、上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin)兔抗人多克隆抗體(批號AF6759)、波形蛋白(Vimentin)兔抗人單克隆抗體(批號AF1975)、神經性鈣黏附蛋白(N-cadherin)兔抗人多克隆抗體(批號AF0243)、RhoA兔抗人單克隆抗體(批號AF2179)、Rac1兔抗人多克隆抗體(批號AF7854)、Cdc42兔抗人單克隆抗體(批號AF2794)均購自上海碧云天生物技術有限公司;GAPDH兔抗人多克隆抗體(批號PA1-16777)、山羊抗兔lgG(H+L)二級抗體(批號A32731)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

HeracellTM240i型CO2細胞培養箱、Multiskan Sky型全波長酶標儀、GENESYSTM50型可見光/紫外分光光度計均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;Gel DocTMXR+型凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司;2720型實時熒光定量PCR(Real time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)儀購自美國ABI公司;LW300LFT-LED型熒光顯微鏡購自北京測維光電儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 含藥血清的制備

將50只SPF級雌性SD大鼠隨機分為5組:不含藥血清組、舒尼替尼陽性藥物組、2.07 g/kg(1/2等效劑量)四君子湯給藥組、4.14 g/kg(1倍等效劑量)四君子湯給藥組、8.28 g/kg(2倍等效劑量)四君子湯給藥組,每組10只,給藥劑量參照“人和動物按體表面積折算的等效劑量比率表”計算。不含藥血清組給予生理鹽水灌胃,灌胃體積5 mL;舒尼替尼組給予10.14 g/kg舒尼替尼灌胃,每天1次,灌胃體積5 mL;各四君子湯組給予對應劑量的四君子湯分別進行灌胃處理,每天2次,每次2.5 mL;連續7 d,第8天末次給藥1 h,麻醉后,無菌環境下經腹動脈采血,4℃靜置2 h,離心(3000 r/min,15 min)3次,同組合并上清,56℃滅活30 min,過濾除菌,得不含藥血清、舒尼替尼含藥血清、四君子湯低、中、高劑量組含藥血清,-20℃保存備用。

1.3.2 細胞培養及分組

將SKOV3細胞接種于含有10%胎牛血清的McCOY’s 5A培養基,在37℃、5% CO2培養箱中培養至細胞融合80%左右,每隔1 d更換一次培養液。取對數期生長的SKOV3細胞,隨機分為空白對照組、舒尼替尼組、四君子湯I組、II組、III組,接種于96或6孔板,分別用體積分數為20%的不含藥血清(空白對照組)、舒尼替尼含藥血清(舒尼替尼組)、四君子湯低劑量含藥血清(四君子湯I組)、四君子湯中劑量含藥血清(四君子湯II組)和四君子湯高劑量含藥血清(四君子湯III組),處理24 h,其中96孔板培養液量為每孔200 μL,6孔板培養液量為每孔2 mL,收集細胞用于后續實驗。另將用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養的人卵巢上皮細胞接種于96孔板,按照上述方法分組并處理24 h后用于后續實驗。

1.3.3 MTT實驗

向1.3.2各組SKOV3細胞孔板中加入5 μL 5 mg/mL MTT溶液,培養箱孵育4 h,吸去上清液,每孔添加100 μL二甲基亞砜,37℃搖床震蕩10 min,570 nm下測量各孔OD值,計算細胞存活率,以上每組設置6個復孔。存活率(%)=(實驗孔OD值-調零孔OD值)/(對照組OD值-調零孔OD值)。按照上述方法測定人卵巢上皮細胞的存活率。

1.3.4 劃痕實驗

待1.3.2各組SKOV3細胞融合至85%左右,用200 μL槍頭垂直劃痕,PBS清洗3次,加入無血清培養基,置于37℃、5% CO2培養箱中培養,顯微鏡下觀察并記錄0 h和24 h時劃痕變化情況,計算各組細胞愈合率。愈合率=(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

1.3.5 Transwell實驗

收集1.3.2各組SKOV3細胞,調整濃度為每毫升2×105個,取200 μL接種于預鋪設Matrigel基底膠的上室,下室添加每孔500 μL完全培養液,置于37℃、5% CO2培養箱24 h,甲醛固定25 min,結晶紫染色25 min,隨機抽取6個視野,高倍(×200)顯微鏡下觀察并計數.

1.3.6 蛋白免疫印跡分析實驗

收集1.3.2各組SKOV3細胞,加入RIPA裂解液裂解,測量各組總蛋白含量。取等量蛋白上樣、12%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、脫脂牛奶封閉4 h,洗膜,加入一抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、RhoA、Rac1、Cdc42和GAPDH(1∶1000),4℃孵化過夜,洗膜然后加入二抗(1∶5000),室溫封閉1 h,TBST洗膜,曝光顯影并記錄,計算目標蛋白相對表達值。目標蛋白相對表達量=目標條帶灰度值/GAPDH灰度值。

1.3.7 qRT-PCR實驗

按照TRIzol說明書,提取1.3.2各組細胞總RNA,純化后,使用紫外分光光度儀計算RNA純度(OD260nm/OD280nm),逆轉錄(37℃60 min,95℃3 min)得cDNA。以各組cDNA為模板,進行擴增反應。PCR反應條件:95℃預變性3 min,95℃變性15 s,60℃退火40 s,95℃延伸15 s,共40次循環。以GAPDH為內參,采用2-ΔΔCT法分析RhoA、Rac1和Cdc42基因表達情況。RhoA、Rac1、Cdc42及GAPDH引物序列見表1,均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 RhoA、Rac1、Cdc42和內參GAPDH引物序列Table 1 Primer sequences of RhoA,Rac1,Cdc42 and internal reference GAPDH

1.4 統計學方法

以統計學軟件SPSS 22.0分析實驗數據,計量資料以平均數±標準差(ˉx±s)描述,多組間比較使用單因素方差分析,進一步兩組間比較行SNK-q檢驗,當P<0.05時,差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四君子湯含藥血清對SKOV3細胞及人卵巢上皮細胞存活率變化影響

與空白對照組相比,舒尼替尼組SKOV3細胞存活率顯著降低(P<0.05),四君子湯I、II、III組SKOV3細胞存活率依次降低(P<0.05),呈劑量依賴性。四君子湯III組與舒尼替尼組SKOV3細胞存活率差異無統計學意義(P>0.05)。各組人卵巢上皮細胞存活率差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組SKOV3細胞及人卵巢上皮細胞存活率變化情況(ˉx±s,n=6)Table 2 Changes in survival rate of SKOV3 cells and human ovarian epithelial cells in each group

2.2 四君子湯含藥血清對SKOV3細胞遷移能力的影響

與空白對照組相比,舒尼替尼組SKOV3細胞劃痕愈合率顯著降低(P<0.05),四君子湯I、II、III組SKOV3細胞劃痕愈合率依次降低(P<0.05),呈劑量依賴性。四君子湯III組與舒尼替尼組細胞劃痕愈合率差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、表3。

圖1 各組SKOV3細胞遷移圖片Figure 1 SKOV3 cell migration pictures of each group

表3 四君子湯含藥血清作用后各組SKOV3細胞劃痕愈合率(ˉx±s,n=6)Table 3 Healing rate of scratches of SKOV3 cells in each group after the effect of Sijunzi decoction-containing serum

2.3 四君子湯含藥血清對SKOV3細胞侵襲數量變化

與空白對照組相比,舒尼替尼組SKOV3細胞侵襲數量顯著降低(P<0.05),四君子湯I、II、III組SKOV3細胞侵襲數量依次降低(P<0.05),呈劑量依賴性。四君子湯III組與舒尼替尼組細胞侵襲數量差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表4。

表4 四君子湯含藥血清作用后各組SKOV3細胞侵襲數量(ˉx±s,n=6)Table 4 Number of SKOV3 cell invasion in each group after the effect of Sijunzi decoction

2.4 四君子湯含藥血清對SKOV3細胞EMT相關蛋白表達的影響

與空白對照組相比,舒尼替尼組SKOV3細胞E-cadherin蛋白表達顯著升高(P<0.05),N-cadherin和Vimentin蛋白表達顯著降低(P<0.05),四君子湯I、II、III組SKOV3細胞E-cadherin蛋白表達依次升高(P<0.05),N-cadherin和Vimentin蛋白表達依次降低(P<0.05)。四君子湯III組與舒尼替尼組細胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、表5。

表5 各組SKOV3細胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達情況(ˉx±s,n=6)Table 5 E-cadherin,N-cadherin and Vimentin protein expression of SKOV3 cells in each group

2.5 四君子湯含藥血清對RhoA、Rac1和Cdc42表達的影響

與空白對照組相比,舒尼替尼組SKOV3細胞RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表達顯著降低(P<0.05),四君子湯I、II、III組SKOV3細胞RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表達依次降低(P<0.05)。四君子湯III組與舒尼替尼組細胞RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4、表6。

表6 各組SKOV3細胞RhoA、Rac1和Cdc42 mRNA表達情況(ˉx±s,n=6)Table 6 RhoA,Rac1 and Cdc42 protein expression of SKOV3 cells in each group

注:A:空白對照組;B:四君子湯I組;C:四君子湯II組;D:四君子湯III組;E:舒尼替尼組。圖2 四君子湯含藥血清對SKOV3細胞侵襲能力的影響(結晶紫染色)Note.A,Blank control group.B,Sijunzi Decoction I group.C,Sijunzi Decoction II group.D,Sijunzi Decoction III group.E,Sunitinib group.Figure 2 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on the invasion ability of SKOV3 cells(Crystal violet staining)

注:A:空白對照組;B:四君子湯I組;C:四君子湯II組;D:四君子湯III組;E:舒尼替尼組。圖3 各組SKOV3細胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達電泳圖Note.A,Blank control group.B,Sijunzi Decoction I group.C,Sijunzi Decoction II group.D,Sijunzi Decoction III group.E,Sunitinib group.Figure 3 E-cadherin,N-cadherin and Vimentin protein expression electrophoresis of SKOV3 cells in each group

注:A:空白對照組;B:四君子湯I組;C:四君子湯II組;D:四君子湯III組;E:舒尼替尼組。圖4 各組SKOV3細胞RhoA、Rac1和Cdc42蛋白表達電泳圖Note.A,Blank control group.B,Sijunzi Decoction I group.C,Sijunzi Decoction II group.D,Sijunzi Decoction III group.E,Sunitinib group.Figure 4 RhoA,Rac1 and Cdc42 protein expression electrophoresis of SKOV3 cells in each group

3 討論

OC具有骨盆腔廣泛擴散的特征,癌細胞的轉移是造成這種結果的重要原因[7]。目前,OC的治療主要以外科手術治療為基礎,輔以化學療法,但大多數患者會在術后階段復發,導致OC的5年生存率僅為44%[8]。血清藥理學是一種廣泛用于中藥和復方藥物藥效及藥理機制研究的實驗方法,已證實臭牡丹含藥血清能夠抑制肝癌細胞的增殖和遷移[9]。

四君子湯四君子湯來源于宋代《太平惠民和劑局方》,由人參、白術、茯苓和甘草組成,主要含有多糖、皂苷和黃酮類等有效成分,具有增強免疫、抗腫瘤和抗衰老等作用[10]。近來研究顯示,四君子湯在抗腫瘤方面能夠抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力[11]。本研究結果顯示,與空白對照組相比,四君子湯含藥血清I、II、III組和舒尼替尼組人卵巢上皮細胞存活率差異無統計學意義,提示四君子湯含藥血清對人卵巢上皮細胞存活率無影響。黃曉燕等[12]和洪亞群等[13]研究發現,四君子湯含藥血清或其有效成分對腸癌SW480細胞或胃癌細胞具有增殖抑制作用。本研究發現,與舒尼替尼組相比,四君子湯III組SKOV3細胞存活率、愈合率、侵襲數量差異無統計學意義;與空白對照組相比,四君子湯I、II、III組SKOV3細胞存活率、愈合率、侵襲數量依次降低,提示四君子湯含藥血清能有抑制人卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲行為,高濃度的四君子湯含藥血清和舒尼替尼作用相當。

上皮-間質化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是惡性腫瘤浸潤轉移的關鍵步驟,與腫瘤細胞的侵襲和遷移密切相關[14-15]。在該過程中,對上皮細胞黏附連接至關重要的E-cadherin蛋白表達下降,而間充質標記物N-cadherin和Vimentin表達升高[16]。本研究發現,與空白對照組相比,四君子湯I、II、III組SKOV3細胞E-cadherin蛋白表達依次升高,N-cadherin和Vimentin蛋白表達依次降低,提示四君子湯含藥血清可以抑制人卵巢癌細胞的EMT進程。Liu等[17]研究顯示,通過抑制EMT過程能夠調節卵巢癌的轉移能力,因此推測四君子湯含藥血清可能通過抑制EMT進程,干預卵巢癌細胞的遷移和侵襲,可能為四君子湯應用于OC的輔助治療提供了參考。

Rho家族小分子鳥苷三磷酸酶(Small GTPases of Rho family,Rho GTPases)包含小型GTpases的Ras超家族的子家族,能夠誘導肌動蛋白細胞骨架動力學和基因轉錄的協調變化,驅動細胞黏附、遷移、形態變化等[18-19]。RhoA、Rac1和Cdc42是Ras超家族的三個重要成員,在調節細胞EMT進程中發揮重要作用[20]。在乳腺癌腫瘤細胞中,抑制RhoA、Rac1和Cdc42表達,能夠促進細胞間質向上皮樣轉變,并促進E-cadherin表達[21]。本研究發現,與空白對照組相比,四君子湯I、II、III組SKOV3細胞RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表達呈劑量依賴性降低,四君子湯III組作用效果與舒尼替尼作用效果相當,提示四君子湯對人卵巢癌細胞EMT過程的抑制作用,可能與抑制RhoA/Rac1/Cdc42信號通路相關。舒尼替尼是一種多靶點抗腫瘤藥物,可以通過抑制多個受體的酪氨酸激酶活性參與實體瘤的發生發展,本研究發現舒尼替尼能夠抑制RhoA/Rac1/Cdc42信號通路抑制卵巢癌細胞的生物學行為,推測舒尼替尼的抗腫瘤機制也可能與RhoA/Rac1/Cdc42信號通路或其相關蛋白有關,但四君子湯含藥血清和舒尼替尼的具體作用靶點是否一致,仍待考究。另有研究顯示[22],RhoA、Rac1和Cdc42表達下調可以抑制類風濕性關節炎中的成纖維滑膜細胞的遷移和侵襲,因此推測,四君子湯含藥血清可能通過抑制RhoA/Rac1/Cdc42信號通路,抑制細胞EMT發生,從而抑制人卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲。此外,四君子湯含藥血清中含有人參皂苷Rb1、Re、Rg1、甘草酸、甘草次酸和甘草素葡萄糖醛酸六種化學成分[23-24],其中人參皂苷Rb1[25]和甘草酸[26]已分別被證實能夠抑制乳腺癌細胞的EMT和遷移及侵襲,而人參皂苷Re對腫瘤細胞具有抑制作用[27],人參皂苷Rg1主要用于神經系統疾病的治療[28],因此四君子湯含藥血清中調控RhoA/Rac1/Cdc42信號通路的具體有效成分尚不明確,需進行更深入的研究和探索。

綜上所述,四君子湯含藥血清對人卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲行為的抑制作用,可能與抑制RhoA/Rac1/Cdc42信號通路,抑制EMT發生相關,表明四君子湯在OC治療方向具有潛在治療或輔助治療價值,可能為臨床治療OC提供了新的思路和方法。但鑒于OC發病機制及四君子湯中藥成分的復雜性,本課題組將針對四君子湯中不同成分組合含藥血清對卵巢癌細胞的作用效果,以及四君子湯含藥血清有效成分對RhoA/Rac1/Cdc42信號通路及卵巢癌細胞的影響進行更深入的研究和探索,以期能夠完善四君子湯含藥血清對卵巢癌藥理學分析。