中樞神經系統TauT基因敲除大鼠的構建及對線粒體DNA氧化損傷影響

夏一鳴黃曉玲仝慧慧齊浩銘莫麗冬王 辰范維佳黃慧玲?

(1.天津醫科大學,天津 300070;2.天津市環湖醫院,天津市神經外科研究所,天津市腦血管與神經變性重點實驗室,天津 300350)

基因敲除技術是通過同源重組將靶基因的某些重要外顯子或功能結構域、甚至所有外顯子敲除掉,導致靶基因的表達失敗。而條件性基因敲除技術可以對感興趣的特異性組織或細胞中的細胞進行時空特異性的敲除,卻不造成生物本身的死亡。自從1994年Gu等[1]第一次報道了利用噬菌體P1的Ⅰ型拓撲異構酶Cre重組酶條件性敲除DNA聚合酶β片段后,在新型基因打靶中,Cre-loxP重組系統獲得廣泛應用,成為條件性打靶技術、誘導性基因打靶、時空特異性基因打靶策略核心。隨著CRISPR/Cas9技術的迅速崛起,使用CRISPR/Cas9技術和Cre-loxP技術條件性敲除小鼠或大鼠已成為基因敲除研究的新型方式。

?；撬?taurine,Tau)是一種內源性的含硫β-氨基酸,化學結構式為H2N-CH2-CH2-SO3H。Tau雖不參與蛋白質的合成,但是具有非常廣泛的營養生理作用[2]。Tau能夠改善低蛋白孕鼠甲狀腺功能,可以促進大腦的發育[3-4]。在腦組織中,Tau含量水平非常高,高達40 mmol/L[5]。研究表明:長期缺乏Tau將導致腦萎縮、心力衰竭、視網膜病或免疫缺陷[6-7]。文獻報道以及我們的前期研究顯示:Tau對維持機體正常功能有廣泛的生物學作用,對神經組織缺血、缺氧及缺血再灌注損傷具有明顯的防治作用[8]。

Tau主要是通過細胞膜上高親和性的牛磺酸轉運體(taurine transporter;TauT;slc6a6)逆濃度梯度主動跨膜轉運,以維持腦細胞內的Tau高濃度(胞內濃度約為細胞外的400倍),調節腦細胞滲透壓[9]。TauT由621個氨基酸組成,分子質量約為70×103,存在于細胞膜上,包含12個跨膜螺旋結構域。一個分子的Tau的主動攝取需要2~3個鈉離子和1個氯離子轉運進細胞質[10]。TauT的活性對Tau的轉運起著至關重要的作用。

我們的課題一直關注Tau對神經疾病后線粒體功能的影響,我們的研究和文獻報道也證實:Tau對線粒體功能穩定具有重要的保護作用[11-12]。線粒體(mitochondrion)被稱為細胞的氧化中心和“動力工廠”,為有機體提供約90%的能量。線粒體參與很多疾病的生理、病理過程。一方面,Tau是線粒體tRNA的組成部分,線粒體tRNA中缺乏Tau修飾會引起線粒體疾病[13-14]。另一方面,它可抑制多種刺激下介導的細胞凋亡[15-16],Tau的缺乏會引起線粒體呼吸鏈復合酶Ⅰ、Ⅲ活性降低,ATP生成減少、超氧化物生成增加和自噬的缺陷[17-18]。

傳統Tau缺乏模型的構建基本采用加入胍基乙烷磺酸鹽等TauT抑制劑,或者通過喂養不含Tau食物的飼料來抑制Tau的攝入[19-20]。在本課題中,我們首次利用Cre-loxP技術和CRISPR/Cas9技術構建神經特異性敲除TauT基因大鼠模型(TauTloxP/loxP/Cre+),使得TauT基因能夠在大鼠腦組織中穩定敲除,克服了傳統Tau缺乏模型的不穩定、持續時間短等缺點。這為研究Tau對神經系統中的作用提供了新的長久模型,并可以在此平臺下研究TauT在各種神經疾病治療和診斷中的作用及分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

神經特異性表達Nestin-Cre雄性大鼠,SPF級,1只,體重200 g(購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所[SCXK(京)2019-0011]);TauTloxP/WT大鼠雌雄各1只,體重200 g,委托中國醫學科學院醫學實驗動物研究所基因工程創制平臺構建;實驗所用的條件性敲除大鼠(TauTloxP/loxP/Cre+大鼠)為Nestin-Cre大鼠和TauTloxP/WT大鼠雜交后獲得。實驗中所用TauTloxP/loxP/Cre+大鼠、野生型SD大鼠(WT大鼠,北京華阜康生物科技股份有限公司購買[SCXK(京)2019-0008])均為SPF級健康雄性大鼠,2月齡大鼠每組各24只,體重(250±30)g。12月齡大鼠每組各2只,體重(850±30)g。

TauTloxP/WT和Nestin-Cre大鼠以及WT大鼠均在中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心SPF環境中飼養[SYXK(津)2019-0002],溫度25℃左右、空氣濕度保持在50%、明暗循環12 h/d。實驗研究的全部動物均遵守3R原則且通過中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物倫理委員審查(DWLL-20180916和DWLL-20180917)。

1.2 主要試劑與儀器

體外轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司,Am1345);EasyPure Genomic DNA Kit(北京全式金生物技術有限公司,EE101-12);2×Taq PCR StarMix、總RNA提取試劑盒、FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(天根生化科技(北京)有限公司,KT201、DP419、KR118、FP205);高效RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司,R0010);PageRulerTMPlus Prestained Protein Ladder(美國Thermo公司,26619);Millipore Western blot ECL(德國Merck公司,WBKLS0500);TauT一抗(英國St John’s Laboratory,STJ95923);GAPDH一抗(美國Proteintech公司,60004-1-lg);HRP標記的山羊抗小鼠二抗、抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司,ZB-2305、ZB-2301);Bradford蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,P0006);動物細胞/組織活性線粒體分離試劑盒、線粒體呼吸鏈復合物I(NADH-輔酶Q還原酶,Complex I)、線粒體呼吸鏈復合物II(琥珀酸-輔酶Q還原酶,Complex II)、線粒體呼吸鏈復合物III(輔酶Q-細胞色素C還原酶,Complex III)、線粒體呼吸鏈復合物IV(正鐵細胞色素C-氧化還原酶,Complex IV)、線粒體呼吸鏈復合物V(F0F1-ATP酶/ATP合成酶,Complex V)的活性比色法定量檢測試劑盒(上海杰美基因醫藥科技有限公司,GMS10006.2、GMS50007、GMS50008、GMS50009、GMS50010、GMS50083);高電流電泳儀PowerPacTMHC(美國Bio-RAD公司,1645052);多功能成像系統(法國Vilber公司,HC006);PCR儀(杭州博日科技股份有限公司,TC-96/G/H(b));熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司,LC480);顯微鏡(日本OLYMPUS公司,BX53);全自動免疫組化儀(德國Leica公司,BOND-Ⅲ);紫外/可見分光光度儀(英國JENWAY公司,6850)。

1.3 實驗方法

1.3.1 TauTloxP/loxP/Cre+大鼠的構建

TauTloxP/loxP/Cre+大鼠模型構建首先需要利用CRISPR/Cas9技術構建TauTloxP/WT雜合子大鼠。一方面針對TauT基因第5外顯子390 bp序列兩端設計兩個不同的sgRNA序列(Rat-TauT-gRNA-up:5’-TAGGCCCCTTTGTCCCACAGAC-3’,Rat-TauT-gRNAdown:5’-AAACGTCTGTGGGACAAAGGGG-3’;RTauT-gRNA-up:5’-TAGGGACAGACCCTGTCTCTGG-3’,R-TauT-gRNA-down:5’-AAACCCAGAGACAGG GTCTGTC-3’),合成的sgRNA單鏈通過退火復性結合成小片段,連接到BsaI酶處理的線性化的表達質粒(pUC57-sgRNA)中,經質粒的連接、轉化后再通過Dra I內切酶線性化后轉錄出sgRNA。另一方面構建Cas9表達載體(pST1374-NLS-flag-linker-Cas9),再用Age I內切酶線性化轉錄出Cas9 mRNA。通過將體外轉錄的sgRNA和Cas9 mRNA以及TauT基因第5外顯子兩端各含有一個loxP序列的供體通過顯微注射法注射進SD大鼠受精卵,利用同源重組獲得F0代TauTloxP/WT雜合子大鼠(圖1所示)。

圖1 利用CRISPR/Cas9技術構建TauTloxP/W T大鼠示意圖Figure 1 TauTloxP/WT rat schematic diagram constructed by CRISPR/Cas9 technology

將獲得的TauTloxP/WT大鼠雜交繁殖得到TauTloxP/loxP純合子大鼠,并和Nestin-Cre大鼠進行雜交,獲得TauTloxP/WT/Cre+轉基因大鼠,再由TauTloxP/WT/Cre+大鼠和TauTloxP/loxP大鼠雜交得到神經特異性TauTloxP/loxP/Cre+基因敲除大鼠。

1.3.2 TauTloxP/loxP/Cre+大鼠PCR鑒定

將出生21 d左右的大鼠,剪趾編號并提取基因組總DNA,PCR擴增目的條帶,電泳成像分析。根據兩個loxP外端基因序列設計引物。loxP上游引物:5’-ATTCAGTCACTCATCCGTCCCT-3’,下游引物:5’-TCTGACAGTTAAAGAATCTAAGGCTCA-3’,片段大小為712 bp。Cre鑒定上游引物:5’-TACTGACGGTGGGAGAATG-3’,下 游 引 物:5’-CTGTTTCACTATCCAGGTTACG-3’,片段大小為432 bp。將鑒定的TauTloxP/loxP/Cre+大鼠,提取腦組織DNA進一步PCR鑒定,TauTloxP/loxP/Cre+大鼠在腦組織中loxP引物擴增條帶為290 bp。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測TauTloxP/loxP/Cre+、WT大鼠腦及各器官TauT基因表達量

2月齡TauTloxP/loxP/Cre+大鼠、WT雄性大鼠腦及各臟器組織研磨后取100 mg左右,提取總RNA,接著反轉錄成cDNA后,進行實時熒光定量PCR(qPCR)。TauT目的基因引物序列:上游5’-GAGGTCATCATAGGCCAGTAC-3’;下 游5’-GTACACATTCAGGAGGGACAC-3’,片段大小為120 bp。GAPDH內參引物序列:上游5’-AACTCCCA TTCTTCCACC-3’;下 游5’-ACCACCCTGTTGCT GTAG-3’,片段大小為100 bp。20 μL PCR反應體系:2×SuperReal PreMix Plus 10 μL,ddH2O 7.8 μL,引物各0.6 μL,cDNA模板1 μL。qPCR反應條件:95℃15 min預變性,95℃15 s,60℃1 min,40個循環。

qPCR相對定量分析:2-△△Ct法,其中[△△Ct=(待測目的基因平均Ct值-待測內參基因平均Ct值)-(對照組目的基因平均Ct值-對照組內參基因平均Ct值)]。

1.3.4 Western blot檢測TauTloxP/loxP/Cre+、WT大鼠腦及各器官TauT蛋白表達

2月齡TauTloxP/loxP/Cre+大鼠、WT雄性大鼠腦組織及心、肝、腎,勻漿裂解后,11430 r/min心10 min,取上清,Bradford法測定蛋白濃度。上樣總蛋白濃度為40 μg,SDS-PAGE電泳,70 V,40 min后轉120 V至溴酚藍條帶到底部,300 mA轉膜90 min,5%脫脂奶粉封閉2 h,TauT一抗(1∶1000)、GAPDH一抗(1:10000),4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,TauT用山羊抗兔二抗(1∶10000)和GAPDH使用的山羊抗小鼠二抗(1∶10000)常溫孵育2 h,TBST洗膜3次,顯影、成像。

1.3.5 免疫組化及HE染色

選取2月齡、12月齡TauTloxP/loxP/Cre+大鼠和WT大鼠各2只,用PBS心臟灌注至血液流盡后,換4%多聚甲醛繼續灌注至大鼠身體僵硬,取腦,4%多聚甲醛固定24 h,脫水,石蠟包埋,切片脫蠟至水后,分別做HE染色和免疫組化。HE染色:蘇木精染色,水洗,伊紅染色,水洗,脫水封片,鏡下觀察。免疫組化:取2月齡大鼠的切片脫蠟至水后,封閉、TauT一抗(1∶100)、沖洗、TauT二抗孵育、沖洗、DAB染色、蘇木精復染、脫水透明、封片,鏡下觀察并分析。1.3.6 TauTloxP/loxP/Cre+、WT大鼠腦組織mtDNA拷貝數檢測

2月齡TauTloxP/loxP/Cre+大鼠、WT雄性大鼠腦組織研磨后取100 mg左右,提取總DNA,使用40 ng DNA作為起始量,進行實時熒光定量PCR。目的基因COXⅠ上游基因引物:5’-TAATTCGAGCTGAA CTAGGAC-3’,下 游 引 物:5’-TACAAGTCAGTTC CCGAAGC-3’;片段大小143 bp。內參基因Rpl4上游基因:5’-CACGCAAGAAGATTCATCGC-3’,下游引物5’-AACAATCTTCTCCGATTTGGC-3’;片段大小194 bp。20 μL PCR反應體系:2×SuperReal PreMix Plus 10 μL,ddH2O 7.8 μL,引物各0.6 μL,模板1 μL。qPCR反應條件:95℃15 min預變性,95℃15 s,60℃1 min,40個循環。計算方法同1.3.3。

1.3.7 TauTloxP/loxP/Cre+、WT大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復合酶活性測定

線粒體呼吸鏈復合酶活力的測定,均根據試劑盒說明書操作執行。簡單來說,將2組大鼠腦組織剪碎勻漿后,1430 r/min,10 min取上清,再9525 r/min,10 min取沉淀,反復凍融破碎線粒體后,Bradford法測蛋白濃度,然后使用紫外/可見分光光度儀進行線粒體呼吸鏈酶活性測定。Complex I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分別在340 nm、600 nm、550 nm、550 nm、340 nm波長下測吸光度。酶活力計算公式:【(樣品讀數-背景讀數)×體系容量(mL)×樣品稀釋倍數】÷【樣品容量(mL)×毫摩爾吸光系數×反應時間(min)】=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克。Complex I/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ結果單位分別為:μmol NADH/(min·mg);μmol DCPIP/(min·mg);μmol CoQH2/(min·mg);μmol CytC/(min·mg);μmol NADH/(min·mg)。

1.4 統計學方法

應用SPSS 17.0和GraphPad Prism 8軟件進行數據分析。實驗結果數據均以平均數±標準差(ˉx±s)表示,組間比較采用獨立t檢驗,P<0.05時表示組間具有顯著差異,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 大鼠構建及遺傳分析

基因測序和序列比對結果顯示loxP序列被成功插入在第5外顯子兩端(圖2A、2B)。我們對插入的loxP序列進行遺傳分析。TauTloxP/WT×WT出生的F1代中只有陰性和雜合子;TauTloxP/WT×TauTloxP/WT出生的F2代TauTloxP/loxP大鼠比例為22.2%;TauTloxP/WT×TauTloxP/loxP出生的F3代中TauTloxP/loxP大鼠比例為52.4%。綜上,loxP插入TauT基因第5外顯子兩端后能夠穩定的遺傳,且符合孟德爾遺傳定律,結果如表1所示。

表1 F1~F3代大鼠繁殖情況Table 1 Reproduction of F1~F3 generation rats

2.2 基因型鑒定結果

新生大鼠腳趾DNA的PCR鑒定結果如圖3:TauTloxP/loxP純合子為一條帶,712 bp;TauTloxP/WT雜合子為兩條帶,712 bp和632 bp;TauTWT/WT陰性為一條帶,632 bp(圖3A);Cre為一條帶,437 bp(圖3B);TauTloxP/loxP/Cre+大鼠腦組織TauT基因被敲除后條帶大小為290 bp(圖3C)。

注:A:基因測序結果顯示第5外顯子兩端插入loxP序列(紅色框);B:與基因組序列比對結果顯示第5外顯子兩端loxP序列被插入。圖2 loxP基因序列比對結果Note.A,Gene sequencing results showed that loxP sequences were inserted at both ends of the fifth exon(red box).B,Comparison with the genome sequence showed that loxP sequences were inserted at both ends of the fifth exon.Figure 2 loxP gene sequence alignment results

注:M:DNA標記;A:1、2:TauTloxP/WT;3、4:TauTWT/WT;5:TauTloxP/loxP;B:1、2、3、4:Cre陽性;C:1:大腦TauT基因敲除結果;2:小腦TauT基因敲除結果。圖3 條件性基因敲除大鼠部分PCR鑒定結果Note.M,DNA marker.A,1/2,TauTloxP/WT.3/4,TauTWT/WT.5,TauTloxP/loxP.B,1,2,3 and 4,Cre positive.C,1,Result of brain TauT gene knockout.2,Result of cerebellar TauT gene knockout.Figure 3 Partial PCR identification results of conditional gene knockout rats

此外,通過RT-PCR顯示:TauTloxP/loxP/Cre+大鼠大腦和腎組織TauT mRNA表達量相比較WT組顯著降低;而在心、肝組織中TauT mRNA表達量沒有顯著差異(如圖4)。

2.3 Western blot及免疫組化檢測TauTloxP/loxP/Cre+、WT大鼠腦組織及各器官TauT蛋白的表達

免疫印跡實驗結果顯示:TauTloxP/loxP/Cre+大鼠TauT蛋白在腦組織中表達顯著降低,而在心、肝、腎組織中和WT大鼠蛋白表達量并無明顯差異(如圖5A、5B)。

此外,通過免疫組化觀察TauTloxP/loxP/Cre+大鼠大腦皮層和海馬(CA3區)和小腦中TauT蛋白表達與WT組大鼠相比明顯減少,而在心、肝、腎組織兩者無明顯差異。這與免疫印跡結果一致(如圖6)。

2.4 TauTloxP/loxP/Cre+、WT大鼠腦組織HE染色結果

從HE染色結果顯示:2月齡TauTloxP/loxP/Cre+大鼠與WT大鼠相比,大腦皮質和海馬DG區細胞數量和密度有所減少(圖7A/7B、7A1/7B1)。而12月齡的TauTloxP/loxP/Cre+大鼠與WT大鼠相比,大腦皮質和海馬DG區細胞極性消失,結構排列疏松紊亂,細胞核胞漿分界模糊(圖7C/7D、7C1/7D1)。此外,12月齡大鼠腦皮質和海馬DG區與2月齡大鼠相比,細胞結構疏松,細胞排列不規則,這種現象在12月齡的TauTloxP/loxP/Cre+大鼠中更加明顯(如圖7)。

注:TauTloxP/loxP/Cre+大鼠和WT大鼠TauT mRNA表達相對定量分析比較。與WT組比較,??P<0.01。圖4 TauTloxP/loxP/Cre+和WT大鼠腦組織及各器官TauT mRNA表達情況(n=6)Note.TauT mRNA expression in TauTloxP/loxP/Cre+rats and WT rats was compared quantitatively.Compared with WT group,??P<0.01.Figure 4 TauT mRNA expression in brain tissues and organs of TauTloxP/loxP/Cre+rats and WT rats

2.5 TauTloxP/loxP/Cre+、WT大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復合物酶活性和mtDNA相對表達量檢測

結果顯示:和WT大鼠相比,TauTloxP/loxP/Cre+大鼠線粒體呼吸鏈復合酶Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ均顯著低于WT組酶活性,而只有線粒體復合酶Ⅱ沒有受到影響(如圖8A;表2)。此外,TauTloxP/loxP/Cre+大鼠腦組織mtDNA表達量比WT大鼠顯著升高(如圖8B)。

表2 TauTloxP/loxP/Cre+大鼠和WT大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復合酶活性測定(ˉx±s,n=6)Table 2 Activity of mitochondrial respiratory chain complex enzymes in brain tissues of TauTloxP/loxP/Cre+rats and WT rats

注:A:TauTloxp/loxp/Cre+大鼠和WT大鼠心、肝、腦、腎TauT蛋白表達情況;B:TauTloxp/loxp/Cre+大鼠和WT大鼠組蛋白表達相對定量分析比較。與WT組比較,??P<0.01。圖5 TauTloxp/loxp/Cre+大鼠和WT大鼠大鼠腦組織及其它器官TauT蛋白表達情況(n=6)Note.A,Expression of TauT protein in heart,liver,brain and kidney of TauTloxp/loxp/Cre+rats and WT rats.B,Relative quantitative analysis of TauT protein expression in the TauTloxp/loxp/Cre+and WT groups.Compared with WT group,??P<0.01.Figure 5 TauT protein expression in brain tissues and other organs of TauTloxp/loxp/Cre+rats and WT rats

注:A、A1:2月齡WT大鼠皮質、海馬;B、B1:2月齡TauTloxp/loxp/Cre+大鼠皮質、海馬;C、C1:12月齡WT大鼠皮質、海馬;D、D1:12月齡TauTloxp/loxp/Cre+大鼠皮質、海馬。圖7 不同月齡TauTloxP/loxP/Cre+大鼠和WT大鼠腦皮質、海馬HE染色Note.A/A1,Cortex and hippocampus of 2-month-old WT rats.B/B1,Cortex and hippocampus of 2-month-old TauTloxP/loxP/Cre+rats.C/C1,Cortex and hippocampus of 12-month-old WT rats.D/D1,Cortex and hippocampus of 12-month-old TauTloxP/loxP/Cre+rats.Figure 7 HE staining of cerebral cortex and hippocampus in TauTloxP/loxP/C re+rats and WT rats of different months of age

注:A、B、C、D、E、F:TauTloxp/loxp/Cre+大鼠心、肝、腎、皮質、海馬(CA3)、小腦;G、H、I、J、K、L:WT大鼠心、肝、腎、皮質、海馬(CA3)、小腦。圖6 TauTloxp/loxp/Cre+大鼠和WT大鼠在心、肝、腎、皮層、海馬和小腦免疫組化結果比較Note.A/B/C/D/E/F,TauTloxp/loxp/Cre+rat heart,liver,kidney,cortex,hippocampus(CA3),cerebellum.G/H/I/J/K/L,WT rat heart,liver,kidney,cortex,hippocampus,cerebellum.Figure 6 Comparison of immunohistochemical results in the heart,liver,kidney,cortex,hippocampus and cerebellum of TauTloxp/loxp/Cre+and WT rats

注:A:TauTloxP/loxP/Cre+大鼠和WT大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復合物酶活性;B:TauTloxP/loxP/Cre+大鼠和WT大鼠腦組織mtDNA相對表達量。與WT組比較,?P<0.05,??P<0.01。圖8 TauTloxP/loxP/Cre+大鼠和WT大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復合物酶活性和mtDNA相對表達量(n=6)Note.A,Activity of mitochondrial respiratory chain complex in brain tissue of TauTloxP/loxP/Cre+rats and WT rats.B,Relative expression levels of mtDNA in brain tissues of TauTloxP/loxP/Cre+rats and WT rats.Compared with WT group,?P<0.05,??P<0.01.Figure 8 Activity of mitochondrial respiratory chain complex enzyme in TauTloxP/loxP/Cre+rat and WT rat brain tissues

3 討論

傳統的條件性敲除技術需要使用胚胎干細胞的同源重組、胚胎操作、顯微注射和輔助生殖技術[21],操作繁瑣,實驗周期長[22]。目前,對于TauT敲除模型的研究,一般通過敲除TauT第1外顯子或者第2~5外顯子形成TauT全身性敲除小鼠,TauT的全身性敲除會引起心肌功能的損傷和視網膜變形以及運動能力的減弱[23-24]。眾所周知,大鼠提供的人類疾病模型,尤其是神經疾病的行為學和藥理學上,大鼠比小鼠提供更有效的生理學指標[25-26]。本文我們用SD大鼠,選擇TauT第5外顯子,運用CRISPR/Cas9技術在基因組中產生精確的雙鏈斷裂,提高了基因打靶的效率,同時利用同源重組機制,整合轉染的同源DNA模板[27-28]。結合Cre-loxP技術,構建TauT在中樞神經系統中特異性敲除大鼠模型。查閱文獻,這是在國際上Tau領域中第一次利用大鼠的TauT基因的條件性敲除報道,進一步證明CRISPR/Cas9技術介導目的基因的條件性敲除是一種十分可靠的方法[22]。

本實驗成功構建了TauTloxP/loxP/Cre+大鼠模型,從大鼠繁殖情況來看,插入的loxP序列可以穩定遺傳,且符合孟德爾遺傳定律。通過RT-PCR結果顯示:與WT大鼠比較,TauTloxP/loxP/Cre+大鼠在腦組織中TauT mRNA表達水平顯著降低,表明TauT基因的確被明顯敲除。免疫印跡顯示:與WT相比,TauTloxP/loxP/Cre+大鼠TauT表達在腦中顯著降低,而在心、肝和腎中TauT表達并無顯著差異,這與大腦組織的免疫組化結果一致。對提取TauTloxP/loxP/Cre+大鼠的小腦做免疫組化結果也表明了TauT蛋白的敲除。但是在本實驗中發現大腦組織仍有少量的TauT的基因和蛋白表達,這可能與Nestin-Cre大鼠有關。為了實現中樞神經系統TauT基因的特異性敲除,Cre重組酶的表達受大鼠Nestin啟動子和內含子2增強子控制。Nestin是神經干細胞特征性標志物,在胚胎發育早期的神經上皮中表達,對神經元分化具有重要作用。由于Nestin神經特異性啟動只在神經干細胞中表達,而我們的樣本是取自大鼠半腦,這其中包含著大量的細胞類型,可能包含著TauT表達的細胞,從而導致產生了少量的TauT表達。

有趣的是,在對心、肝和腎組織的TauT mRNA表達水平研究發現:TauTloxP/loxP/Cre+大鼠的心和肝組織TauT mRNA表達水平沒有受到影響,腎組織中TauT mRNA表達水平卻顯著降低,但不影響其TauT蛋白表達。這種結果表明:Nestin-Cre介導的重組不僅發生在神經外胚層,也發生在腎細胞類型中。這也證實了Dubois研究Nestin-Cre大鼠在腎中表達的結果[29]。本實驗中我們多次實驗證實大鼠腎的TauT mRNA基因下降而蛋白質表達不變,表明對于腎,中樞神經TauT敲除只是影響其轉錄水平,還未出現翻譯水平的變化即蛋白功能的變化。這可能是由于mRNA表達量的下調不足以引起蛋白表達量的變化。一般而言,真核生物中基因表達的轉錄和翻譯兩個水平所發生時間和位點存在時空間隔,后者因磷酸化等一系列轉錄后修飾,對蛋白功能的調控比較復雜。由于不同的半衰期,mRNA和蛋白質水平有時不能直接相關,有時會有相反的結果。

從基因敲除大鼠表型上觀察,我們很難判斷TauTloxP/loxP/Cre+大鼠和WT大鼠之間的區別。觀察其生長1~6月齡體重變化過程中,TauTloxP/loxP/Cre+大鼠并沒有顯示出明顯的不同,出生也沒有出現致死現象,其腦、心、肝、腎、肺、脾等臟體系數的比較也無明顯區別(數據未列出)。這與我們同期所構建的TauT全身性敲除大鼠會體重減輕有所不同[30]。對TauTloxP/loxP/Cre+大鼠的核磁共振檢測,也未發現實驗大鼠腦部無明顯病變,核磁波譜也顯示ROI區的Tau水平無明顯差異(數據未列出)。但HE染色顯示:TauTloxP/loxP/Cre+大鼠腦皮質、海馬DG區細胞數量和致密度有所減低,這可能是由于TauT的敲除會導致Tau供給不足,使腦組織細胞體積調節能力降低,從而影響了腦組織細胞形態、數量的變化。此外,TauT敲除在腦中可能出現時間累積效應。與年老的WT大鼠相比,年老大鼠TauTloxP/loxP/Cre+大鼠腦皮質和海馬DG區細胞出現極性消失,結構排列疏松、紊亂以及細胞核胞漿分界模糊等現象,這些結果表明TauT敲除會加速大鼠的衰老。

利用我們所構建的TauTloxP/loxP/Cre+大鼠模型,我們初步研究了腦組織線粒體的mtDNA和線粒體呼吸鏈復合酶I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性。發現中樞神經系統的TauT的條件性敲除會抑制腦組織線粒體呼吸鏈復合酶I、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性,而復合酶Ⅱ的活性沒有收受到影響。我們分析,這可能與Tau的抗氧化特性和阻止線粒體滲透性的轉變有關[11],TauT敲除抑制了Tau的攝取,從而導致線粒體抵抗細胞內的氧化應激和滲透性轉變能力降低,線粒體呼吸鏈復合酶活性降低,ATP合成的減少。而大鼠腦組織mtDNA的拷貝數可能是對其線粒體ATP減少所做的代償性的增加[31]。后期我們進一步實驗進行論證。

綜上所述,我們用CRISPR/Cas9和Cre-loxp技術成功構建了中樞神經系統TauT敲除大鼠模型,發現TauT的敲除對腦組織的形態、線粒體呼吸鏈復合酶活性及mtDNA拷貝數都有著較顯著影響,為研究Tau及TauT在中樞神經系統中的作用提供一種有效的實驗平臺,為進一步研究Tau治療神經疾病的機理提供了一種穩定而有力的工具。