非人靈長類帕金森模型的研究進展

劉永芳吳正存馬開利

(1.中國醫學科學院&北京協和醫學院,醫學生物學研究所,昆明 650118;2.中國醫學科學院&北京協和醫學院,醫學靈長類研究中心&神經科學中心,北京 100005)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是帕金森氏綜合征廣泛運動障礙中最常見的形式,以步態不穩、肌肉僵直、運動遲緩、靜止性震顫為特征。新的診斷標準將姿勢不穩排除在外。目前,全球PD患病人數超過六百萬,65歲以上人群發病率大約為1.5%[1],中國占全球發病人數的一半。據統計,隨著人口老齡化,截至2030年,全球50歲以上發病率將會增加一倍[2]。已有研究表明,PD的病理改變主要是中腦黑質多巴胺能神經元的進行性丟失、紋狀體多巴胺神經遞質的減少以及α突觸核蛋白包涵體的形成。臨床上,PD患者確診時已經是疾病的中晚期,丟失了50%~60%多巴胺能神經元和60%~70%的多巴胺能神經遞質,大多出現運動癥狀,晚期伴有疼痛和抑郁,嚴重影響患者的生活質量。而疾病早期,多數患者會出現便秘、嗅覺障礙、睡眠障礙等非運動癥狀[3]。在確診之前,這些非運動癥狀往往并不會和PD聯系起來。目前,PD的治療藥物以多巴胺前體藥物左旋多巴和多巴胺受體激動劑為主,但隨著服用時間的延長,這些藥物的療效會逐漸減弱,并會引起藥物引發的震顫[4]。近些年來,非侵入性的深部腦刺激療法取得了良好的效果,可以緩解患者的疼痛,干細胞療法也開始走向臨床。但這些治療手段的發現和評價都離不開動物模型的建立,一個最接近臨床PD患者發病過程和病理變化的動物模型將有利于PD的發病機制、診斷、治療方法以及藥物篩選的研究。

嚙齒動物已經廣泛用于建立PD模型,而非脊椎動物,如果蠅、線蟲、斑馬魚,由于其神經元數量少,便于操作,可進行藥物高通量篩選,也常用于PD模型的建立。非人靈長類(non-human primate,NHP),在進化上與人類關系更近,大小、行為、生理、生化、免疫功能方面與人類更相似,更適合用于模擬人類疾病模型。最常用來建立PD模型的NHP有狨猴和獼猴。猴子具有一定的學習、認知、情緒、社交能力[5]。這使得相比較于嚙齒動物和豬,猴子更便于測試精細運動和非運動癥狀。猴腦和人腦的高度相似使得能用磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)和正電子發射計算機斷層顯像(positron emission tomography,PCT)對大腦結構和功能進行非侵入性高分辨率成像。這些證據均表明NHP是更適合研究PD的動物,因此,本文通過總結和闡明PD的NHP模型研究現狀,為基于NHP的PD模型的藥物評價及機制研究提供參考和依據。

1 神經毒素誘導模型

1.1 MPTP模型

MPTP,全稱1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶,其可通過血腦屏障,被膠質細胞膜上的單胺氧化酶B(monoamine oxidase B,MAO-B)代謝為1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridine ion,MPP+),后者可由多巴胺轉運體(dopamine transporter,DAT)轉運至細胞內,與線粒體復合物Ⅰ結合,損傷氧化呼吸鏈,選擇性損傷多巴胺能神經元[6]。因此,MPTP是最常用的制備PD模型的神經毒素。不同獼猴物種對MPTP的敏感性不同,同一物種間不同猴子個體敏感性也有差異。食蟹猴和恒河猴同屬于獼猴。食蟹猴對MPTP的敏感性強于恒河猴[7]。Potts等[7]通過回顧108只獼猴靜脈注射MPTP的方案,給出建議:①單次MPTP注射后,3~8周內運動障礙會自發恢復,因此建議最后一次MPTP注射后,至少8周內每周進行一次癥狀評估;②多次低劑量注射MPTP,可以減少并發癥的發生;③可根據動物的行為學調整MPTP劑量,直到出現“明顯運動障礙”為止。在靜脈注射MPTP的方案中,猴子雖能保持相對穩定的癥狀,但仍然不能模擬PD慢性發生的過程。Seo等[8]在此基礎上作了改進,建立起一個穩定的慢性NHP帕金森模型:一周兩次小劑量(0.2 mg/kg),左股骨區肌肉注射給藥,給藥48周后,模型猴的紋狀體和黑質TH陽性神經元明顯丟失,同時還發現模型猴中的T淋巴細胞慢性浸潤到了腦部。類似的,Masilamoni等[9]采用慢性MPTP給藥方案(0.2~0.5 mg/kg,肌肉注射,一周一次,持續21周),在猴子模型中重現了PD病人大腦中多巴胺能神經元退變的模式。另有團隊采用前17周每周一次肌肉注射給予0.2 mg/kg劑量的MPTP,后4周調整為0.5 mg/kg的給藥方案,也建立出了穩定的獼猴帕金森模型[10]。慢性給藥方案中,模型猴中腦腹側神經元丟失多于背側,而急性方案中腹側和背側丟失情況差不多。頸靜脈注射所需要的MPTP劑量一般會比皮下給藥的劑量要小。一周一次0.5 mg/kg MPTP皮下注射狨猴,總劑量2.5 mg/kg和6 mg/kg時,并未發現腦部明顯的病理變化,行為學也不明顯并且還發生恢復[11-12]。皮下連續給予MPTP,似乎能有更好的PD癥狀和病理表現。采用連續3 d分別2 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg皮下注射的給藥方法,模型猴的左右兩側大腦損傷程度不一致,行為學特征持續了1年以上[13]。

老年猴通常比青年猴更易感。老年恒河猴單側給予MPTP,可誘導出中度帕金森癥狀。5~9歲恒河猴所需要的MPTP劑量是20~23歲猴的三倍[14]。普遍認為,老年動物可能更能模擬PD病人的實際情況,但也存在不同看法。Shi等[15]發現給老年恒河猴0.2 mg/kg劑量肌肉注射MPTP,第1次連續注射15 d,間隔8周后,第2次連續注射30 d,期間模型猴病情變化不可控,于是采用青年恒河猴分兩段給予MPTP:肌注+靜脈注射,呈現了穩定的運動和非運動癥狀[16]。以往的MPTP模型研究中,大多檢測到猴子腦中有α突觸核蛋白(αsynuclein,α-syn)沉積,但沒有發現磷酸化的α-syn聚集體。但近幾年有研究者將MPTP給予恒河猴后,發現可產生p-α-syn和路易病理,但無法重現特發性PD尾狀核-殼核漸變的特征[17]。NHP的MPTP模型總結見表1。

表1 非人靈長類MPTP模型總結Table 1 Summary of MPTP NHP model

1.2 6-OHDA模型

6-OHDA,中文名稱6-羥多巴胺,是一種多巴胺(dopamine,DA)類似物,可競爭性抑制DAT對DA的攝取,進入細胞后可抑制線粒體復合物Ⅰ和線粒體復合物Ⅳ的活性。6-OHDA不能通過血腦屏障,一般需要進行腦立體定位注射。對猴腦要進行多點注射,以保證藥物的均勻分布和減少自發恢復的發生。DA神經遞質的丟失、行為學的改變與6-OHDA劑量呈正相關性。關于6-OHDA關注的一個問題是注射部位的選擇。研究人員將180~216 μg的6-OHDA多點注射到狨猴的皮層和尾狀核進行比較,發現二者引起注意力發展方向不同[18]。單側注射到狨猴紋狀體內,5月后病變側DA能神經元丟失46%,運動功能和感覺功能出現異常[19];注射到黑質,能引起多巴胺能神經元丟失80%,非多巴胺能神經元丟失77%,猴子出現姿勢改變,記憶障礙[20]。有人認為,單側模型并不能完全模擬PD的癥狀。2004年,Milton等[21]發現左側注射的PD模型猴子表現出空間和運動癥狀的單方面缺陷,而雙側注射的PD模型可能表現出雙側的精神障礙。2015年,Santana等[22]分兩個階段對狨猴內側前腦束5個位點進行腦立體定位注射6-OHDA,總劑量為120 μg,發現產生了持續的帕金森癥狀。另外研究采用靜脈注射的給藥方式,以50 mg/kg劑量全身應用6-OHDA,引起了心臟交感神經去支配[23]、炎癥、氧化應激、PPARγ激活[24]、近端結腸兒茶酚胺損失[25]。

2 轉基因模型

目前已有的PD轉基因模型主要基于α突觸核蛋白野生型及其A53 T突變型(第53位氨基酸由丙氨酸突變為蘇氨酸)。同時,利用病毒載體局部或全身過表達制作轉基因動物的方式,因方便、快捷而受到科研人員的青睞,并且,有效病毒載體遞呈系統及高效的遞送方式的選擇是轉基因動物成功的關鍵。

2.1 遞呈系統的選擇

目前,常用的轉基因制備的病毒載體有腺相關病毒(adeno-associated viral vector,AAV)和慢病毒(lentivirus,LV)。

2.1.1 AAV病毒系統

AAV是單鏈DNA病毒,包裝容量大約4.7 kb,對外源基因的表達能力中等。因其不整合到宿主基因組中,因此目的基因可能在宿主傳代的過程中丟失。目前共發現12種血清型(AAV1-AAV12),不同血清型對組織的特異性不同。神經領域使用較多的血清型有2、5、8、9型。AAV2型主要針對神經系統;AAV5型針對肺、眼、神經系統;AAV8型針對肝、肌肉、眼、神經系統;AAV9型針對肺、肝、肌肉、心臟和神經系統,且AAV9型在NHP腦部軸突中可以進行雙向運輸[26]。運用失去復制能力的AAV假病毒已成為趨勢,尤其是以2型為核心,其他型為衣殼蛋白的血清型病毒。Allocca等[27]發現AAV2/5型載體可容納的基因組可擴大到8.9 kb。Gerits團隊比較了不同血清型和不同啟動子下報告基因在恒河猴新皮層的轉導效率,發現鈣調蛋白激酶II(CaMKIIα0.4)啟動子下,病毒的傳播效率為:rAAV2/5>>rAAV2/7>rAAV2/8>rAAV2/9>>rAAV2/1,轉導細胞的比例為:rAAV2/1>rAAV2/5>rAAV2/7=rAAV2/9>rAAV2/8[28]。與嚙齒動物不同,通用巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)啟動子在恒河猴腦中效果最差。而另一研究組給6只獼猴右殼核和同側內囊注入相同劑量的病毒,發現rAAV2/1、rAAV2/2和rAAV2/5在大腦中的總體擴散沒有顯著差異。而在大腦和遠端神經元結構(脊髓和周圍神經)中,rAAV2/1和rAAV2/5在每個細胞中的載體拷貝數高于rAAV2/2[29]。利用AAV2/9遞送基因發現,無論動物年齡,轉導的最主要的細胞類型都是星形膠質細胞和小膠質細胞。據此,綜合考量與實際案例來看[30-32],目前,AAV2/5型和AAV2/9型可能更適合作為PD造模的血清型,AAV2/1也可作為參考。

2.1.2 LV病毒

LV是一種由人免疫缺陷病毒改造而來的單鏈RNA病毒,包裝容量<9 kb,能隨機整合在宿主基因組中。2001年,美國科學家將滅活的慢病毒注射進獼猴體外受精的胚泡中,制備了第一只攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的轉基因猴“安迪”,但綠色熒光蛋白基因并不在其生殖細胞中表達[33]。2008年,Yang等[34]在4~8細胞期的胚胎中注射攜帶亨廷頓基因的高滴度的慢病毒,第一個亨廷頓恒河猴模型誕生,但至此,尚未證明基因能向后代傳遞。2009年,日本科學家將滅活的5.6×109~5.6×1011/mL滴度的EGFP-慢病毒注射到狨猴最早時期的胚胎中,EGFP在狨猴后代中多個器官中表達,實現了種系的傳遞[35]。

2.2 遞送方式

2.2.1 局部注射

在NHP中,腦立體定位普遍針對黑質和紋狀體,而未見有報道直接采用腦室注射。2003年,Kirik等[30]率先用AAV2型載體通過腦立體定位注射的方式向黑質內遞送野生型及A53T突變型的αsyn,16周后發現A53T突變引起30%~60%的黑質多巴胺能神經元丟失,存活的黑質神經元細胞中90%~95%的細胞有陽性α-syn包涵體。利用rAAV2/5型載體在成年猴腹側中腦中表達人野生型α-syn,然而神經變性僅局限于尾狀核多巴胺能神經纖維[31],并且他們還證實過表達人A53T能導致黑質多巴胺能細胞死亡[36]。這證明A53T毒性強于野生型α-syn。Koprich等[32]利用AAV2/1型載體讓黑質內過表達α-syn A53T突變體發現病毒滴度為1.7×1012時沒有顯著性的病理變化;而當滴度達到5.1×1012時黑質多巴胺能神經元減少50%,紋狀體多巴胺減少60%,且病毒表達持續至少4個月。這些證據表明,成年猴腦立體定位注射AAV載體可以實現局部的目的基因表達,并能表現出一定的相關表型,且可通過調整病毒滴度來控制目的基因的表達量。

除了腦立體定位外,為了探究α-syn從腸道逆行傳播到大腦的假說,Manfredsson等[37]將AAV2/5-CBA-α-syn注射到結腸和胃,發現腸神經系統明顯的α-syn病理,但猴子腦中并沒有任何病理出現。

2.2.2 全身給藥

(1)成體全身給藥

為了提高轉導效率,近幾年開始不斷嘗試宮內感染、出生后進行靜脈注射或鞘內給藥。2003年,Garrett等[38]將rAAV2-GFP注射進羊膜囊,72 h后開始表達和分泌GFP,并且維持了1年以上。rAAV2/9靜脈注射能通過血腦屏障,并長期表達。獼猴圍生期后期,研究人員將scAAV9-CMV-eGFP通過臍靜脈注射進兩只獼猴胎兒,病毒轉導到了中樞和外周神經系統[39]。同時,給P1、P30、P90、3歲的食蟹猴靜脈注射rAAV2/9-GFP,發現成年猴子比年輕猴子轉導效率低[40]。這些數據表明,幼年比成年神經元更容易受到病毒感染。AAV9型病毒鞘內給藥也可以實現基因的持續表達,長達4年[41]。

(2)卵母細胞或胚胎時期注射

相比于胎兒或新生兒,更早的時間點還可以選擇卵母細胞或胚胎前期。Niu等[42]以109/mL滴度的人A53T突變型慢病毒遞送至MⅡ期恒河猴卵母細胞,之后進行體外受精(in vitrofertilization,IVF)和胚胎植入,成功制作6只A53T轉基因猴,進一步檢測證實A53T突變基因在全身器官中表達,并出現了年齡相關的認知缺陷和焦慮,并且A53T突變的猴腦比鼠腦具有更廣泛的神經變性。其中,值得注意的是,注射時機的選擇對轉基因猴組織表達的廣泛性具有重要的作用。2016年,Seita團隊用帶人類巨細胞病毒即刻早期增強子和雞β肌動蛋白啟動子的GFP慢病毒表達載體注射食蟹猴,產生了全身表達GFP的轉基因猴[43],但發現向受精前的成熟卵母細胞注射LV表達系統,可在組織中實現均勻的GFP表達,而向受精卵中注射病毒則產生鑲嵌表達的轉基因猴。2017年,Tomioka團隊報道,他們使用四環素誘導的慢病毒載體表達系統產生了新型的轉基因猴[44]。

3 基因編輯技術

基因編輯技術,如鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFN)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENS)、成簇的規則間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspersed short palindromic repeats,CRISPR),可以實現定點編輯。ZFN是第一個可編程的核酸酶。1996年,有報道將模塊鋅指蛋白(zinc finger protein,ZFP)與Fokl限制酶非特異切割域融合,ZFN由此產生。Folk核酸酶必須二聚體才具有切割功能。ZFP由包含結合鋅原子的半胱氨酸和組氨酸對的30個氨基酸殘基組成,即ZF基序,每個ZF基序識別3~4 bp的序列,通過將α螺旋插入DNA大溝來與DNA結合。與ZFN類似,將來源于植物病原體的TAL效應子模塊融合到Folk切割域上,稱作TALENS。TALENS制作核酸酶的方式更簡單。CRISPR/Cas是細菌免疫系統的一部分,這個技術被分為兩部分:單個指導RNA(single guide RNA,sgRNA)和一個Cas核酸內切酶。最常用的Cas核酸內切酶是Cas 9。ZFN成本高,效率低;TALENS效率高、脫靶率低、構建周期短;Cas 9效率是TALENS的5倍,實際操作更簡單。

目前,這幾種技術在哺乳動物中都有一定的應用,但在帕金森猴中的應用仍極為有限。近幾年,日本科學家Coghlan等[45]通過基因組編輯技術突變了狨猴的SNCA基因,產生了第一只帕金森狨猴模型,狨猴在第一年出現睡眠障礙,第二年腦干出現路易病理,第三年發生震顫。2019年,國內學者楊偉莉等[46]使用CRIPSR Cas9技術生成了第一只PINK1敲除猴,其皮層、紋狀體、黑質出現顯著神經元退性?；蚓庉嬘兄鴱姶蟮膽们熬?但基因編輯技術難度高,仍存在脫靶、鑲嵌表達模式、低同源重組的缺點,仍面臨要攻關很多問題。

4 PFF模型/LB模型

路易小體(Lewy bodies,LB)是PD的病理性標志,而LB中主要成分為淀粉樣纖維聚集體,α-syn是其中含量最高的成分[47]。于是α-syn聚集體和PD的關系令人著迷。現在普遍認為α-syn單體和規則整齊的纖維是無毒的,而寡聚體和形成纖維之前的原纖維(preformed fibrils,PFF)是有毒的形式。其PFF的制備已經有一定的基礎和成形的方案,而寡聚體的制備仍然存在難度。將制備的α-syn PFF注射進猴子體內的確產生了PD病理。Shimozawa等[48]向成年狨猴紋狀體內注射α-syn PFF,三月后,α-syn S129磷酸化免疫反應檢測陽性,而且α-syn從紋狀體向黑質擴散,誘發了PD樣α突觸核蛋白病理,這是第一個狨猴α-syn傳播模型。有團隊向獼猴腸道接種α-syn PFF,1個月后,在迷走神經和藍斑背側運動核檢測到少量的病理性α-syn,研究持續12個月后,腸神經系統仍有穩定病理性的α-syn,而腦組織中卻并未發現[37],這說明α-syn從外周傳遞到中樞可能只是偶然事件。

將PD患者腦中提取的LB接種到猴子黑質或紋狀體內,也可以引起α-syn病理和神經退行性病變[49]。最近,Arotcarena等[50]向狒狒的紋狀體或腸道注射PD患者來源的α-syn聚集體,然而迷走神經中并未發現α-syn病理學的改變,該研究同樣不支持通過迷走神經和背側運動核傳遞α-syn的假說。

5 討論

NHP的生命周期較長,這使得我們有機會來觀察造模過程中的病理變化。目前,MPTP模型是PD模型的金標準。神經毒物模型方法簡單,易操作,病理變化一般與劑量呈正相關。由于人類對MPTP極其易感,所以使用MPTP對實驗室和操作人員要求較高,防止造成MPTP泄露。而6-OHDA不能通過血腦屏障,多采取一次腦立體定位注射,相對安全很多。而神經毒物造成的傷害一般比較直接,一般沒有報道有路易小體的形成,且容易錯過PD前期的發病過程。因此,推薦低劑量、長時間給藥。轉基因模型通常有一定難度。合格的轉基因模型應該具備以下特征:①基因能整合到宿主基因組中;②基因能表達且有生物活性;③種系傳遞[51]。因為,AAV并未整合在基因組中,所以,AAV載體遞送的基因在猴子傳代的過程中可能會發生丟失。另外,研究顯示小鼠腦中pα-syn水平與黑質紋狀體變性程度有關,而與小鼠不同的是,猴子的p-α-syn水平與神經變性之間沒有相關性[52]。值得注意的是,猴子本身的α-syn就含有A53T突變,所以,猴子體內過表達α-syn A53T突變的蛋白是否能代表人體內的A53T突變表型有待考證。CRISPR技術與其他基因編輯技術相比,可以實現對特定的基因位點進行編輯,成本也降低,但操作難度大,仍存在脫靶的問題。然而,轉基因模型可以從基因水平來研究疾病機理,有神經毒物模型不能替代的優點。路易小體是PD患者腦中標志性的病理,而α-syn作為其中主要的成分,被認為PFF形式是有毒的,現在也有人認為寡聚體毒性更強。重組α-syn PFF模型也重現了PD中多巴胺能神經元丟失的特征,但其PFF制備的質量通常不穩定。PD患者腦中提取的LB產物成分更為復雜,達到70多種,不同人員,以及每一批次之間成分的差異可能會導致結果的變異。

6 小結

總之,即使NHP也有一定的缺陷,但仍然是與人類最接近的動物,在研究疾病機理、藥物臨床前安全性評價上仍然具有不可替代的作用,但由于倫理原因,要嚴守3R原則,只在必要的時候使用NHP。

續表1