基于網絡藥理學分析“附子-白術”藥對治療乳腺癌骨轉移的作用機制

賴琦 謝丹 劉樂玲 鄧韞潔 葉甜婧

摘要 目的：基于網絡藥理學分析“附子-白術”治療乳腺癌骨轉移的作用機制。方法：利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫并結合文獻篩選附子和白術的活性成分，使用TCMSP及Swiss Target Prediction數據庫預測作用靶點，通過GeneCards數據庫收集乳腺癌骨轉移的治療靶點，繪制韋恩圖獲取藥物疾病共同靶點，并導入Cytoscape3.7.1軟件構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡。利用STRING數據庫構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，同時利用R軟件進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。結果：“附子-白術”通過25個活性成分作用于205個乳腺癌骨轉移治療靶點。主要通過9種核心活性成分，作用于AKT1、IL6、MAPK3等30個核心靶點，調控雌激素、破骨細胞分化、PI3K-AKT、HIF-1、MAPK等信號通路，發揮治療乳腺癌骨轉移的作用。結論：“附子-白術”通過多成分、多靶點、多通路來調控乳腺腫瘤增殖、凋亡、轉移并減輕骨破壞、骨痛。

關鍵詞 附子;白術;乳腺癌骨轉移;網絡藥理學;中藥;靶點;通路;機制

Analysis of the Mechanism of “Radix Aconiti Lateralis Preparata-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae” Medicine

on Bone Metastasis of Breast Cancer Based on Network Pharmacology

LAI Qi1，XIE Dan2，LIU Leling1，DENG Yunjie1，YE Tianjing1

（1 The First Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510000，China;

2 The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510000，China）

Abstract Objective：To analyze the mechanism of “Radix Aconiti Lateralis Preparata-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae” treatment of breast cancer bone metastasis based on network pharmacology.Methods：TCMSP database and literature were used to screen the active ingredients of Radix Aconiti Lateralis Preparata-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae.TCMSP and Swiss Target Prediction database were used to predict the action target，and the therapeutic target of breast cancer bone metastasis was collected through GeneCards database.Venn diagram was draw to obtain the common target of drug disease，and Cytoscape 3.7.1 software was constructed to construct “drug-component-disease-Target” network.The STRING database was used to construct the protein interaction network，and the R software was used for GO and KEGG enrichment analysis.Results：“Radix Aconiti Lateralis Preparata-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae” acted on 205 breast cancer bone metastasis treatment targets through 25 active ingredients.It was mainly through 9 core active ingredients to act on 30 core targets such as AKT1，IL6，MAPK3，regulating signal pathways such as estrogen，osteoclast differentiation，PI3K-AKT，HIF-1，MAPK function etc.Conclusion：“Radix Aconiti Lateralis Preparata-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae” regulates breast tumor proliferation，apoptosis，metastasis and relieves bone destruction and bone pain through multiple components，multiple targets，and multiple pathways.

Keywords Radix Aconiti Lateralis Preparata; Rhizoma Atractylodis Macrocephalae; Bone metastasis of breast cancer; Network pharmacology; Traditional Chinese medicine; Target; Pathway; Mechanism

中圖分類號：R285;R273文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.015

乳腺癌發病率居女性惡性腫瘤的首位[1]，乳腺癌骨轉移在晚期乳腺癌中的發生率為65%～75%，而首發癥狀為骨轉移者占27%～50%，多為多發性溶骨性病變，常引起骨痛、骨損傷、骨相關事件影響患者生命質量[2]，乳腺癌患者確診骨轉移后的5年生存率僅20%～30%[3]。目前，針對乳腺癌骨轉移的治療方法主要包括放療、化療、內分泌治療、分子靶向治療、手術治療、雙膦酸鹽治療及鎮痛等支持療法[2]，但臨床療效較低，并發癥發生率較高，近年來，中醫藥治療乳腺癌的效果讓越來越多的患者對中國傳統醫藥有了極大的信任，并且大多數患者都積極接受中醫藥治療[4-5]。

乳腺癌骨轉移在中醫學屬“骨痹”“骨瘤”“骨蝕”范疇?！夺t經精義》曰“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所合也”;《素問·五臟生成篇》曰“腎之合骨也，其榮在發，其主脾也”;《景岳全書》曰“脾腎不足及虛弱失調之人，多有積聚之病”。中醫認為腎為先天之本，主骨生髓，脾為后天之本，充養骨髓。相關文獻對乳腺癌骨轉移的中醫證型分布進行統計，毛丹等[6]對110例患者進行分析，發現陽虛寒凝證型最多;許秋琳等[7]對236例患者進行分析，發現肝腎陰虛證組合多（38.13%），其次為脾腎陽虛證組合（35.17%）。因此脾腎陽虛為乳腺癌骨轉移發生的重要病機，中醫治法以溫補脾腎為主。

附子辛、甘、大熱，入心、腎、脾經，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛等功效;白術苦、甘、溫，入脾、胃經，具有健脾益氣、燥濕利水等功效?！案阶?白術”是補火溫中的常用藥對，源于白術附子湯、附子理中丸、實脾飲、真武湯等，其中白術附子湯出自《金匱要略》是治療“骨痹”的代表方劑。臨床研究證實白術附子湯用于治療乳腺癌骨轉移，在減輕疼痛、提高生命質量方面具有一定優勢，還可以緩解因口服阿片類止痛藥物導致的便秘，且安全性高[8-10]?，F代藥理學通過動物實驗表明“附子-白術”是白術附子湯的核心藥物，并且其通過減少破骨細胞的數量并抑制其活性、下調乳腺癌骨轉移組織中骨破壞因子、減少炎癥介質并上調抑炎因子等發揮作用[11-15]。網絡藥理學能對藥物-組成-靶點-信號通路的復雜關系進行分析，在現代藥理學研究的基礎上指導新藥研發和藥理作用研究的新興學科[16]?！案阶?白術”對乳腺癌骨轉移的分子生物研究較多地停留在動物指標，因此我們采用網絡藥理學的方法對“附子-白術”藥對治療乳腺癌骨轉移的藥理機制進行了系統探討，以期為該藥對在臨床使用及實驗研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 “附子-白術”藥對活性成分及作用靶點的獲取

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），分別檢索附子、白術的成分，根據藥物吸收、分布、代謝及排泄特性，將口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18作為篩選標準[17]，滿足條件的作為活性成分，并結合文獻[18-19]補充藥對的活性成分。利用PubChem數據庫（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取活性成分的SMILES表達式。通過TCMSP可檢索部分活性成分對應的靶蛋白，利用Swiss Target Prediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）檢索活性成分的SMILES式以補充藥物的靶蛋白，將兩數據庫的靶點信息進行整合去重。再將靶蛋白信息輸入Uniprot數據庫（http：//www.uni-prot.org/），限定物種為“Human”，使靶蛋白統一轉換為藥物作用的靶基因，即得到“附子-白術”藥對的作用靶點。

1.2 乳腺癌骨轉移治療靶點的獲取

使用GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）以“breast cancer with bone metastasis”為關鍵詞進行檢索，獲得疾病治療靶點。

1.3 藥物與疾病共同靶點的篩選

在Venny2.1在線軟件作圖工具平臺上分別錄入白術、附子與乳腺癌骨轉移的靶點，繪制韋恩圖，得到“藥物-疾病”的共同靶點。

1.4 網絡模型的構建及分析

將藥物活性成分、藥物與疾病的共同靶點導入Cytoscape3.7.1軟件，構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖，使用Network Analyzer對“附子-白術”的主要活性成分進行分析。

1.5 構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡圖

將上述藥物-疾病共同靶點輸入到STRING數據庫（https：//string-db.org/），限定物種為人類，并選取minimum required interaction score>0.4，獲取PPI網絡關系數據，將其導入Cytoscape軟件，繪制PPI網絡。

1.6 通路富集分析

在R軟件安裝Bioconductor軟件包“org.Hs.eg.db”并運行，將藥物與疾病共同靶點轉換成entrezID。然后在R軟件安裝“clusterProfiler”包，根據已轉換的entrezID，以P<0.05，Q<0.05分析關鍵靶基因的功能與信號通路即基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）功能富集分析，并將結果以條形圖形式輸出。

2 結果

2.1 “附子-白術”活性成分及作用靶點

從TCMSP數據庫獲得附子活性成分21個、白術活性成分7個，結合文獻補充納入白術中的白術內酯（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）、蒼術酮、β-桉油醇、α-桉葉醇，附子中的烏頭堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、宋果靈、易混翠雀花堿、尼奧靈、苯甲酰新烏頭原堿、9-去羥基森布星，最終獲得附子活性成分29個、白術活性成分13個，共42個。從TCMSP及Swiss Target Prediction數據庫獲得附子靶點152個、白術靶點176個，去除重復靶點，得到“附子-白術”作用靶點294個。見圖1。

2.2 “附子-白術”與乳腺癌骨轉移的共同靶點

在GeneCards數據庫檢索乳腺癌骨轉移，共獲得疾病靶點6 786個。輸入176個白術靶點、152個附子靶點、6 786個疾病靶點，繪制韋恩圖，取交集后獲得藥物-疾病共同靶點205個。見圖2。即“附子-白術”治療乳腺癌骨轉移靶點。

2.3 “藥物-成分-疾病-靶點”網絡的構建與分析

將“附子-白術”中42個潛在活性成分與205個藥物與疾病相同靶點導入Cytoscape中，獲取“藥物-

成分-靶點-疾病”網絡圖。見圖3。圖中紫色代表藥物，藍色代表中藥復方中的25種活性成分（17個活性成分靶點與疾病靶點無交集，給予刪除），綠色代表205個共同靶點，紅色代表疾病，連線代表其相互關聯。并通過Network Analyzer工具分析網絡中活性成分的度值（Degree），度值越大說明該活性成分與作用靶點的關聯個數越多，該成分越重要。結果顯示，每個活性成分平均與17.84個靶點互相作用，度值大于20的活性成分有9個，其中α-香樹精（Alpha-Amyrin）與53個靶點關聯，α-桉葉醇（Alpha-Eudesmol）與50個靶點關聯，準噶爾烏頭堿（Songorine）與42個靶點關聯，β-谷甾醇（3S，8S，9S，10R，13R，14S，17R）-10，13-dimethyl-17-[（2R，5S）-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2，3，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol）與39個靶點關聯，白術內酯Ⅱ（AtractylenolideⅡ）與35個靶點關聯，苯甲酰新烏頭原堿（Benzoylhypaconine）與33個靶點關聯，8β-乙氧基白術內酯Ⅲ（8beta-ethoxy atractylenolide Ⅲ）與29個靶點關聯，白術內酯Ⅲ（Atractylenolide Ⅲ）與26個靶點關聯，白術內酯Ⅰ（Atractylenolide Ⅰ）與21個靶點關聯，因此這9種活性成分可能是該藥對起到治療乳腺癌骨轉移作用的核心成分。

2.4 PPI網絡與分析

將上述205個共同靶點輸入STRING數據庫，再導入Cytoscape軟件分析得到PPI網絡。見圖4。圖中圓形節點代表靶點，連線代表靶點與靶點之間的聯系，節點的大小、顏色及其深淺變化代表Degree值的大小，靶點Degree值越大表示該靶點與其他靶點的關聯性越強，并根據Degree值篩選出核心靶點。將Degree值前30作為核心靶點。見圖5。圖中縱坐標代表靶點，橫坐標表示Degree值。

2.5 通路富集分析

205個共同靶點經R語言進行GO和KEGG富集分析，將排前20的結果以條形圖輸出，圖中P值代表富集的顯著性，顏色越紅則顯著性越高。GO富集分析以生物學過程、細胞組分及分子功能為主。見圖6～8。其中，交集基因集合共富集至1 919條生物學過程通路中，主要包括調節循環系統血管管徑、激活蛋白激酶等;交集基因集合共富集至74條細胞組分表達過程中，主要涉及細胞膜的膜筏、突觸膜及神經元細胞體等;交集基因集合共富集至183個與分子功能相關的過程中，主要涵蓋調控類固醇激素受體、核受體、轉錄因子、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性并參與激素結合等。

KEGG功能富集共得到130條信號通路，前20的結果形成KEGG功能富集的條形圖。見圖9。結果顯示共同靶點主要富集于腫瘤、糖尿病等多種疾病，與乳腺癌骨轉移相關的通路主要有雌激素信號通路、破骨細胞分化、PI3K-AKT信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路等。

3 討論

研究證實白術附子湯對乳腺癌骨轉移患者療效確切且“附子-白術”是該方的核心藥物。本研究采用網絡藥理學的方法對“附子-白術”治療乳腺癌骨轉移的活性成分、作用靶點、相關生物信號通路進行了探討。

3.1 “附子-白術”治療乳腺癌骨轉移核心活性成分分析

本研究獲得25個“附子-白術”治療乳腺癌骨轉移的活性成分，并根據藥物、成分、疾病、靶點相互作用的網絡圖，計算活性成分度值，得到9種核心活性成分，依次為α-香樹精、α-桉葉醇、準噶爾烏頭堿、β-谷甾醇、白術內酯Ⅱ、苯甲酰新烏頭原堿、8β-乙氧基白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ。研究表明，苯甲酰新烏頭原堿不僅能誘導實體瘤凋亡如膠質瘤、胃癌、肝癌等，還能促進血液腫瘤凋亡[20-21]。準噶爾烏頭堿屬于C-20二萜型附子生物堿，張亞平等[22]發現附子生物堿可減少小鼠乳腺癌發生率，延長生存期，并改善體寒血瘀癥狀及缺血缺氧的指標，降低血清中雌二醇和孕酮水平;丁薈霞[23]實驗發現附子生物堿有抑制人胃癌細胞株增殖、降低侵襲力、誘導凋亡的作用并與多種化療藥物存在協同作用，其作用機制可能與下調相關基因的表達有關。白術發揮油是發揮抗癌作用的重要成分，α-香樹精、α-桉葉醇皆屬白術揮發油類，研究表明其可加速癌細胞凋亡，減緩癌細胞增殖，增強對腫瘤的細胞毒性效應，抑制向正常組織侵襲轉移能力等[24]。白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ、8-β-乙氧基白術內酯Ⅲ屬于內酯類物質[25]，相關研究表明，白術內酯類可對多種癌細胞產生抗癌作用，包括乳腺癌MCF7細胞，白血病P-388、HL-60細胞，肝癌HepG2細胞，前列腺癌Dul45細胞，肺癌A549細胞，黑色素瘤A875、B16細胞，大腸癌Lovo細胞等[26-30]。白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅲ可通過抑制腫瘤壞死因子-α、一氧化氮、白細胞介素、血管內皮生長因子和胎盤生長因子的產生發揮抗炎作用，且白術內酯Ⅰ的作用強于白術內酯Ⅲ[31-32]。與此同時劉昳等[33]發現白術內酯Ⅰ可以顯著改善患者惡病質。鑒于此，本研究認為“附子-白術”是多種成分共同發揮作用。其中核心成分可通過誘導腫瘤凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、降低腫瘤侵襲及轉移能力發揮抗乳腺癌骨轉移作用，通過抗炎作用減少骨痛，并且可改善患者生命質量。

3.2 “附子-白術”治療乳腺癌骨轉移核心靶點分析

本研究依據PPI網絡，得到30個核心靶點，其中前5位依次為AKT1、IL6、MAPK3、VEGFA、MAPK1。AKT有3個家族成員AKT1、AKT2、AKT3，可通過PI3K被胞外激活，研究發現激活AKT1可促進乳腺癌的增殖，但抑制AKT1功能會促進腫瘤遷移能力[34-35]。炎癥介質可影響惡性腫瘤骨轉移，其中白細胞介素-6（IL-6）在誘導腫瘤細胞增殖、抑制凋亡和刺激破骨細胞生成、抑制成骨細胞分化中具有重要作用[36]。研究發現，乳腺癌骨轉移機制是癌細胞突破基膜侵入周圍基質，進入脈管系統，在脈管系統中成活并逃避免疫監視，并最終到達轉移部位[37]。血管內皮生長因子（VEGFA）有助于新生血管形成，因為腫瘤新生血管的內皮細胞之間沒有密切的連接且沒有被周細胞廣泛覆蓋，所以形成新生血管是癌細胞進入脈管的主要方式[38]。MAPK1、MAPK3是一種絲裂素活化蛋白激酶，通過組成信號通路刺激相關因子調節參與乳腺癌的發生發展和轉移[39]。鑒于此，本研究認為“附子-白術”是多靶點協同作用共同發揮抗乳腺癌骨轉移作用。

3.3 “附子-白術”治療乳腺癌骨轉移通路分析

本研究通過基因KEGG功能富集分析，獲得了雌激素信號通路、破骨細胞分化通路、PI3K-AKT信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路等與乳腺癌骨轉移相關的通路。乳腺癌骨轉移溶骨性改變是腫瘤細胞激活破骨細胞分化通路所致，通過成骨細胞表達RANKL與破骨細胞前體細胞表面上的RANK受體結合促進破骨細胞分化成熟;同時，成骨細胞可通過骨保護素OPG與RANKL競爭性結合，進而抑制RANK-RANKL通路[40]。腫瘤細胞可分泌PTHrP促進成骨細胞表達RANKL，并且破骨細胞破壞骨質同時釋放骨基質中的TGF-β，TGF-β反過來促進腫瘤細胞產生PTHrP，導致使骨質破壞的“惡性循環”[41]。相關研究證實，附子白術湯和附子-白術藥對均可抑制TGFβ信號通路，減少PTHrP的表達，調節OPG/RANKL系統，減輕乳腺癌骨轉移裸鼠溶骨性損傷[12-14]。亦有研究發現，雌激素信號通路可抑制MCF-7細中OPG表達，提高RANKL通路活性，從而促進破骨細胞的破骨作用[42]。PI3K/AKT信號通路相關蛋白磷酸化增強是乳腺癌侵襲和轉移的重要分子機制之一[43]，并且袁翠堂等[44]研究發現PI3K/AKT信號通路參與乳腺癌骨轉移大鼠骨癌痛脊髓水平的調節。HIF-1信號通路是乳腺癌骨轉移的重要通路，其主要通過促使腫瘤細胞適應缺氧微環境;激活SNAIL1、SLUG和TWIST基因，下調上皮細胞鈣黏蛋白表達，使上皮細胞向間葉細胞轉化，誘導癌細胞能動性;促進膠原纖維的生物合成以及線性排列，為腫瘤細胞提供遷移途徑;激活L1CAM蛋白，增加對于血管內皮細胞的黏附;誘導CXCR4表達，引導癌細胞附到骨組織;有利于骨原始細胞聚集并影響成骨細胞與破骨細胞的分化及活性[45]。MAPK通路中的c-Jun氨基末端激酶參與細胞應激與凋亡，p38激酶可調控炎癥反應，細胞外信號調節激酶有利于細胞增殖，大絲裂原活化蛋白激酶可調節細胞周期[46]。目前研究發現阻斷ERK/P-38MAPK信號通路可抑制乳腺癌骨轉移[47]。鑒于此，本研究認為“附子-白術”通過抑制腫瘤細胞表達PTHrP和骨基質細胞釋放TGF-β，以減少成骨細胞表達RANKL;并抑制雌激素信號通路，促進成骨細胞產生OPG，從而阻斷破骨細胞分化通路的惡性循環對骨組織的溶骨性破壞?！案阶?白術”還通過抑制PI3K/AKT、HIF-1、MAPK信號通路阻止腫瘤細胞的轉移，抑制MAPK通路調控腫瘤細胞的增殖與凋亡，抑制PI3K/AKT信號通路減輕骨轉移導致的骨痛。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法，對“附子-白術”藥對的多成分、多靶點、多途徑與乳腺癌骨轉移之間復雜網狀關系進行研究，初步驗證了“附子-白術”藥對治療乳腺癌的基本藥理學作用和相關機制，為進一步深入臨床與實驗研究奠定基礎。

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（2020-04-28收稿 責任編輯：楊覺雄）

基金項目：楊文輝廣東省名中醫傳承工作室建設項目（粵中醫辦函[2019]5號）

作者簡介：賴琦（1995.01—），女，碩士研究生在讀，醫師，研究方向：中醫防治乳腺疾病，E-mail：353569894@qq.com

通信作者：謝丹（1976.07—），女，博士，主任醫師，研究生導師，研究方向：中醫防治乳腺疾病，E-mail：xie-dan@21cn.com