小麥生理型雄性不育系花藥內源JA與ABA含量動態變化及其代謝通路差異基因表達研究

魏霽桐，吳國麗，李慧敏，郭佳林，宋齊魯，張亞敏，牛 娜，王軍衛，馬守才，張改生，朱 峰，宋瑜龍

(1.西北農林科技大學農學院/國家楊凌農業生物技術育種中心/國家小麥改良中心楊凌分中心/小麥育種教育部工程研究中心/陜西省作物雜種優勢研究與利用重點實驗室，陜西楊凌 712100；2.周至縣農業農村局，陜西周至 710400)

小麥作為我國第三大主要糧食作物，其籽粒含有豐富的淀粉和蛋白質，對維持人類生命活動、保障身體健康和推動社會經濟可持續發展起到了至關重要的作用，培育并大面積推廣高產、優質、廣適型小麥新品種仍是當前小麥育種工作的重點[1]。小麥產量、品質、抗逆性等性狀均屬于質量-數量性狀，受主效基因和微效基因共同調控，對于這些復雜的多基因控制的數量性狀來說，傳統的雜交育種方法很難將所有有利基因聚合到1個基因型后代中，因此加快小麥高配合力優異種質資源創新，配制雜交種，免去后代分離與選擇，實現多基因高效聚合，可能是推動高產、優質、廣適小麥新品種選育進程、突破現階段育種瓶頸問題的有效途徑[2]。目前，小麥雜種優勢利用主要有三系途徑(不育系、保持系及恢復系)、光溫敏兩系途徑及化學雜交劑途徑[3]。其中，三系途徑主要存在不育基因轉換耗時、保持系與不育系制種分離費工、恢復源狹窄等問題[4]；光溫敏途徑同樣存在光溫敏基因轉換耗時、花粉育性轉換臨界溫度受環境因素影響較大、育性不穩定等問題[5]，這兩類雜種優勢利用途徑一定程度限制了雜交組合的組配范圍，限制了強優勢雜交組合出現幾率，不利于雜交小麥新組合的鑒選及規模化生產和大面積應用。與三系途徑和光溫敏兩系途徑相比，化學雜交劑途徑不受小麥基因型限制，可以直接誘導任意常規優良品種(系)花粉敗育，作為母本大量組配雜交組合，具有親本選擇范圍廣、強優勢組合出現幾率高、更換組合速度快等優點[6]。因此，利用化學雜交劑誘導小麥花粉敗育，產生生理型雄性不育系，配制小麥雜交種可能是實現小麥雜種優勢利用的最有效途徑之一。

化學雜交劑(chemical hybridizing agent，簡稱CHA)是用于誘導植物花粉敗育，但不傷及雌蕊和影響植物生長發育的一類化學藥劑[7]。SQ-1是我國自主研發的、具有自主知識產權的一類新型高效噠嗪類小麥化學雜交劑，具有殺雄窗口期長、不受母本基因型限制等特點，且誘導花粉敗育率在95%以上，不傷雌蕊，異交結實率穩定在85%以上，對推動雜交小麥進入生產、實現產業化發展具有重要作用[8]。前人在SQ-1誘導小麥花粉敗育機理方面做了大量研究，如：董 劍等[9]利用基因芯片技術對SQ-1誘導的雄性不育及其對照可育系花藥進行了分析，結果在兩類材料中共發現2 052個差異表達基因，其中上調表達基因 1 294個，下調表達基因758個，通路分析表明，上述基因主要參與植物對逆境的響應、多糖代謝和信號傳導等代謝途徑；李亞鑫等[10]對SQ-1誘導的不育系及其對照可育系花藥中交替氧化酶(AOX1)基因表達模式進行了分析，發現與對照可育系相比，AOX1a在花藥單核期表達量最高，二核期表達量減少，但三核期略有上升，推測AOX1a的異常表達可能影響了花藥中的抗氰呼吸途徑，導致抗氰呼吸紊亂，最終引發花粉敗育；朱啟迪等[11]利用轉錄組學技術對SQ-1誘導的小麥生理型雄性不育及其對照可育系單核期花藥進行分析，發現與對照可育系相比，不育系中有 1 088個基因表達模式發生變化，通路分析表明，上述基因共涉及氨基酸代謝、核糖體組分、光合作用及氨基酸代謝、RNA轉運及信號轉導、活性氧代謝等60個代謝通路。此外，又有學者從蛋白質水平、DNA甲基化水平、泛素化修飾水平、代謝組學水平、生理生化代謝水平及細胞學水平對SQ-1誘導的花粉敗育機理進行了系統深入研究，但其分子機理仍未解析清楚[12]。目前在小麥、百合、芝麻等作物上研究表明，植物內源激素在雄蕊發育及育性決定中起著重要作用[13-15]，而有關植物內源激素與SQ-1誘導的小麥生理型雄性不育花粉敗育之間的內在關系尚未見報道。

因此，本研究擬以化學雜交劑SQ-1誘導的小麥生理型雄性不育系及其對照可育系的5個發育時期花藥為材料，研究不育系和可育系轉錄水平基因差異及內源JA與ABA含量的變化，以期揭示小麥生理型雄性不育與內源JA與ABA的關系，為在激素水平解析SQ-1誘導花粉敗育的生理機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

供試小麥品種西農1376及化學雜交劑SQ-1均由西北農林科技大學農學院張改生教授課題組提供。

西農1376于2018年10月種植于西北農林科技大學農作一站。翌年三月，待西農1376發育至Feeke’s 8.5時期(旗葉抽出至倒二葉一半)，將材料分為兩組，一組用5 kg·hm-2的化學雜交劑SQ-1葉面均勻噴施，誘導雄性不育系，記為PHYMS-1376；另一組用等量清水噴施，作為對照可育系，記為CK-1376，其他管理同大田。待PHYMS-1376及CK-1376發育至四分體、單核早期、單核晚期、二核期和三核期時，依據表型分別采集對應時期長勢一致的穗子放入冰盒，迅速帶回實驗室，置于冰上，迅速剝取位于穗中部花藥置于干凈的載玻片上，滴加1.5%醋酸洋紅染色，光學顯微鏡下觀察，確定發育時期。隨后，冰上收集PHYMS-1376和CK-1376 兩個材料5個發育時期的花藥分別放入1.5 mL無酶離心管中，液氮速凍，放入-80 ℃冰箱保存、備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取及轉錄組測序

利用Trizol試劑分別提取PHYMS-1376和CK-1376 四分體、單核早期、單核晚期、二核期、三核期花藥RNA，隨后分別用NanoDrop 2000和Agilent Bioanalyzer 2100檢測其濃度和質量，并對其進行逆轉錄，合成第一鏈和第二鏈cDNA，并進行純化，加接頭，用Agilent Bioanalyzer 2100系統進行質量評估，隨后構建cDNA文庫，委托百邁克生物科技有限公司利用IlluminaHiseqXten平臺測序，設置3次生物學重復。

1.2.2 序列對比與差異基因表達分析

對原始Reads進行過濾，去除低質量的Reads，得到Clean Reads，并利用Tophat2軟件將其與指定的參考基因組進行比對，得到Mapped Data，并基于Nr(NCBI non-redundant protein sequences)、Nt(NCBI non-redundant nucleotide sequences)、Pfam(protein family)、KOG/COG(clusters of orthologous groups of proteins)和Swiss-Prot(a manually annotated and reviewed protein sequence database)數據庫對其進行功能注釋。按照每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的fragments標準完成基因定量，差異表達基因鑒定依賴于DESeq R 包(1.10.1)，篩選標準為 |log2(fold change)|≥1且FDR<0.05，P-value< 0.05。此外，基于Gene Ontology(GO)數據庫(http://geneontology.org)和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數據庫(https://www.genome. jp/kegg/pathway.html)，分別利用GO seqR包和KOBAS 軟件對差異表達基因進行GO富集和KEGG 通路分析。使用GSEA(WWW.gsea-msigdb.org)的方法對JA及ABA信號通路基因進行富集分析。

1.2.3 ABA含量的測定

分別取PHYMS-1376和CK-1376 四分體、單核早期、單核晚期、二核期、三核期花藥約 0.1 g，放入液氮預冷的研缽中磨碎，加入1 mL預冷的甲醇∶水∶乙酸(80∶20∶1)混合液，4 ℃浸提過夜；次日，8 000 r·min-1離心10 min，取上清液4 ℃保存，殘渣用甲醇∶水∶乙酸 (80∶20∶1)混合液0.5 mL浸提2 h，8 000 r·min-1離心10 min，取上清液，并將2次上清液混合，40 ℃條件下，氮氣吹干。依次加入0.5 mL石油醚萃取脫色3次，棄去上層醚相，用飽和檸檬酸將下層液pH調至2.8，之后用等體積的乙酸乙酯萃取3次，并將有機相用氮氣吹干；甲醇定容至0.5 mL，用0.22 μm濾器過濾，存于帶有內襯管的樣品瓶待測。Rigol L3000高效液相色譜儀用于檢測待測樣本ABA含量，首先用流動相(甲醇∶1%乙酸水=50∶50)過Kromasil C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，待基線穩定后，加樣檢測，進樣量10 μL，流速0.8 mL·min-1，柱溫35 ℃，走樣時間30 min，紫外檢測波長254 nm，3次生物學重復。

1.2.4 JA含量測定

分別取PHYMS-1376和CK-1376 四分體、單核早期、單核晚期、二核期、三核期花藥約0.1 g，用80%乙腈浸提過夜；8 000 r·min-1離心10 min，取上清液，氮吹儀上冰浴吹干；加入500 μL水復溶，石油醚脫色3次；用飽和檸檬酸將pH調節至2.5～3.0，充分混勻；再用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，氮吹儀吹干；加入200 μL乙醚∶甲醇(9∶1)溶液復溶，并加入20 μL的 2 mmol·L-1三甲基硅烷化重氮甲烷的正已烷溶液混勻，室溫放置30 min；加入20 μL的 2 mol·L-1冰醋酸正已烷溶液混勻，室溫放置30 min，冰浴氮氣吹干；加入0.5 mL甲醇，用 0.22 μm濾器過濾，存于帶有內襯管的樣品瓶待測。Rigol L3000高效液相色譜儀用于樣本JA含量檢測，首先用流動相過KromasilC18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)等度洗脫，待基線穩定后，加樣檢測，進樣量10 μL，流速 0.8 mL·min-1，柱溫35 ℃，走樣時間40 min，紫外檢測器波長210 nm，3次生物學重復。

1.2.5 ABA與JA通路相關基因的qRT-PCR表達分析

為驗證轉錄組數據的準確性和進一步深入解析ABA與JA信號通路關鍵基因表達與SQ-1誘導的小麥生理型花粉敗育之間的關系，對與ABA信號傳導及JA信號傳導通路相關的差異表達基因進行qRT-PCR定量分析。利用Premier 5設計qRT-PCR引物(表1)，并以18 s基因作為內參，引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應體系：模板(500 ng·μL-1)1 μL，上下游引物(μmol·L-1)各0.4 μL，2×RealStar Green Fast Mixture 10 μL，ROXⅡ0.4 μL，ddH2O補充至 20 μL。反應程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環；3次重復，置于Quant Studio 3 Real-time PCR System(Applied Biosystems,USA)內，規范操作，溶解曲線參照默認值?；蛳鄬Ρ磉_量采用2-△△Ct法計算，數據用SPSS 19.0處理，采用One-Way ANOVA中LSD法進行差異顯著性分析。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Primers used for real-time PCR

2 結果與分析

2.1 轉錄組質量檢測

取SQ-1誘導的西農1376不育系及對照可育系四分體時期、單核早期、單核晚期、二核期、三核期花藥，設置3次生物學重復，共30個樣本進行轉錄組測序。經過質控篩選，共獲得209.79 Gb 的Clean reads，且各樣本Q30≥85.02%，對比參考基因組，比對率在70.16%～78.75%之間(表2)，結果表明，所有試驗樣本的測序質量良好，可用于后續研究。

表2 轉錄組測序結果與對比效率Table 2 Transcriptome sequencing results and alignment efficiency

2.2 差異表達基因分析

分別比對不育系及其對照可育系5個發育時期花藥中基因表達數據，共獲得36 058個差異表達基因，其中上調表達基因18 108個，下調表達基因17 950個。其中，三核期差異表達基因數最多，有14 978個，上調基因6 728個，下調基因 8 250個，其他依是二核期、四分體時期、單核晚期、單核早期，分別有13 832、3 697、1 946、1 605個差異表達基因；繪制韋恩圖發現，不育系與其對照可育系五個發育時期花藥中所共有的差異表達基因數是97個(圖 1)。結果表明：SQ-1誘導小麥花粉敗育過程是一個復雜的多基因參與過程，差異表達基因數受花藥發育時期影響較大，且共有的97個差異表達基因參與了不育系各時期花藥發育及花粉敗育過程。

2.3 差異表達基因的GO功能注釋與KEGG和GSEA富集分析

分別對PHYMS-1376及CK-1376四分體、單核早期、單核晚期、二核期、三核期差異表達基因進行GO分析，結果發現，每個發育時期的差異表達基因均與生物學過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)有關，且生物學過程中細胞進程(cellular process)、代謝進程(metabolic process)、單組織過程(single-organism process)，細胞組分中的細胞組成(cell part)、細胞(cell)、細胞器官(organelle)，分子功能中結合(binding)、催化活性(catalytic activities)等二級功能的基因富集比例較大。與之相比，在細胞組分中病毒(virion)、病毒組成(virion part)、膠原三聚體(collagen trimer)和分子功能中調節翻譯活性(translation regulator activity)和蛋白質標記(protein tag)等二級功能在不同時期差異表達基因中均未富集到，其他二級功能基因富集比率較低，差異較大。

對PHYMS-1376及CK-1376四分體、單核早期、單核晚期、二核期、三核期花藥各時期差異表達基因進行KEGG通路分析，結果發現，三核期花藥差異表達基因富集到代謝通路上的數目最多，有2 518個，其次是二核期、四分體時期、單核晚期、單核早期，分別有2 313、661、387、323個差異表達基因富集到代謝通路。此外，比較分析各時期富集差異表達基因數最多的前9位通路，發現植物激素信號傳導(plant hormone signal transduction)、苯丙素生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)、淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism)、氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)4個通路在PHYMS-1376及CK-1376花藥5個發育時期均能富集到差異表達基因，且植物激素信號傳導(plant hormone signal transduction)途徑在四分體時期富集到差異表達基因比例最高，約占四分體時期差異表達基因總數的16%，其次是單核早期、二核期、三核期、單核晚期，分別約占對應時期差異表達基因總數的8%、6%、5%、4%。結果表明，SQ-1誘導小麥花粉敗育過程是一個復雜的多通路協同調控過程，且植物激素信號傳導(plant hormone signal transduction)、苯丙素生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)、淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism)、氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids )4個通路對引發花粉敗育可能起著至關重要的作用，其中植物激素信號傳導(plant hormone signal transduction)通路可能是引發后續其他通路差異表達基因變化的 關鍵。

利用GSEA方法富集所有與植物激素信號傳導途徑相關的差異表達基因，并重點關注茉莉酸(JA)和脫落酸途徑(ABA)的相關基因，結果發現，24個差異表達基因被富集到了JA通路(圖2-A)，23個差異表達基因被富集到了ABA通路(圖2-B)。對JA通路24個差異表達基因表達量熱圖聚類分析發現，ID為TraesCS2A02G506500、TraesCS2B02G534800、TraesCS4A02G007800、TraesCS4D02G296000的基因表達量顯著高于其他基因。對ABA通路23個差異表達基因表達量熱圖聚類分析發現，ID為TraesCS3A02G371800、TraesCS1A02G2159004的基因表達量顯著高于其他基因。與此同時，兩個通路的差異表達基因在各時期表達量存在顯著差異。

2.4 JA與ABA激素含量分析

利用高效液相色譜技術檢測PHYMS-1376及CK-1376花藥四分體至三核期花藥內源JA和ABA含量，結果發現，與CK-1376相比，JA含量在PHYMS-1376四分體花藥中顯著降低，至單核早期顯著升高，單核晚期又顯著降低，二核期顯著升高，三核期顯著降低(P< 0.05)；ABA含量在PHYMS-1376四分體至三核期花藥中含量均高于CK-1376，其中單核早期、單核晚期和二核期二者間ABA含量差異均顯著(P<0.05)。上述結果表明，PHYMS-1376各發育時期花藥中JA含量的異常波動及ABA含量的顯著增加，可能與SQ-1誘導小麥花粉敗育緊密相關。

2.5 熒光定量PCR結果分析

對富集到的11個ABA通路的重要基因進行定量分析發現，基因表達趨勢與轉錄組測序數據基本一致(表3)。其中，ID為TraesCS1D02G271000的基因在CK-1376四分體至二核期花藥中表達量呈顯著增加趨勢，二核期最大，三核期則顯著降低。與CK-1376相比，該基因在PHYMS-1376四分體至三核期花藥中表達量均顯著降低，二核期表現尤為明顯，三核期表達量最高；TraesCS3B02G266200基因在CK-1376四分體至單核早期花藥中表達量顯著下降，單核晚期上升至最大值，至二核期再次顯著下降，且二核與三核期表達量無顯著差異。與CK-1376相比，該基因在PHYMS-1376四分體至單核早期花藥中表達量顯著升高，單核晚期顯著降低，且二核和三核期表達量與對照無顯著差異；TraesCS2A02G493800基因在CK-1376四分體至二核期花藥中表達量較低，且差異不顯著，至三核期顯著增加到最大值。與CK-1376相比，該基因在PHYMS-1376四分體至三核期花藥中表達量均顯著增加，且四分體至單核晚期持續下降，二核期略有回升，至三核期增加至最大；TraesCS4D02G210900及其等位基因TraesCS4B 02G210100在CK-1376四分體至單核早期表達量呈顯著降低趨勢，單核晚期顯著增加至最大值，二核期顯著下降，三核期顯著升高。與CK-1376相比，上述兩個基因的表達量在PHYMS-1376四分體和單核晚期顯著降低，在單核早期、二核期和三核期顯著升高；TaABA8#OH1及其等位基因TraesCS6A02G271300和TraesCS6B02G298500在CK-1376四分體至單核早期表達量呈顯著增加至最大值，單核晚期至三核期上述3個基因表達量與單核早期相比均顯著降低，但單核晚期至三核期花藥之間以上3個基因表達量無顯著性差異。與CK-1376相比，上述3個基因的表達量在PHYMS-1376四分體和三核期顯著升高，而單核早期顯著降低，其余發育時期二者表達量無明顯差異；TaABA8#OH2及其等位基因TraesCS5A02G238000和TraesCS5B02G236500在CK-1376四分體至單核晚期表達量顯著降低至最小值，二核至三核期上述3個基因表達量顯著增加至最大值。與CK-1376相比，上述3個基因的表達量在PHYMS-1376四分體、單核早期和二核期顯著降低，而在單核晚期和三核期顯著升高。上述結果表明，與對照CK-1376相比，11個參與ABA信號轉導的關鍵基因的表達模式在PHYMS-1376花藥各發育時期均存在不同程度的差異，可能是不育系花藥中ABA含量紊亂的重要原因。

此外，對富集到的3個JA通路的重要基因進行了定量分析，結果(表3)發現，基因表達趨勢與轉錄組測序數據基本一致。其中，TraesCS2A02G506500在CK-1376四分體至單核早期花藥中表達量呈顯著降低，單核晚期至三核期顯著增加至最大值。與CK-1376相比，該基因表達量在PHYMS-1376單核晚期花藥中顯著增加，二核期和三核期表達量顯著降低，在四分體至單核早期二者無顯著差異；TraesCS6B02G324300及其等位基因TraesCS6D02G274700在CK-1376四分體至單核晚期花藥中表達量極低，且無顯著差異，至二核期表達量顯著增加至最大值，三核期顯著降低。與CK-1376相比，上述2個基因的表達量在PHYMS-1376二核期至三核期顯著降低，其余各時期上述2個基因表達量與對照無明顯差異。上述結果表明，與對照CK-1376相比，3個參與JA信號轉導的關鍵基因的表達模式在PHYMS-1376花藥各發育時期同樣存在不同程度的差異，可能是不育系花藥中JA含量紊亂的重要原因。

3 討 論

3.1 基因調控通路與作物雄性不育

SQ-1誘導的小麥生理型雄性不育與細胞質雄性不育及光溫敏雄性不育相比，其花粉敗育機理更為復雜。Liu等[16]通過轉錄組測序的方法對5個同核異質雄性不育小麥材料花藥進行了分析，結果發現，存在27 618個差異表達基因，主要涉及81條代謝通路，如：糖代謝、氧化磷酸化、苯丙烷生物合成和磷脂酰肌醇信號通路等。Ye等[17]利用轉錄組測序技術對K-TCMS不育系花藥進行分析，結果發現，存在16 840個差異表達基因，主要涉及苯丙醇類生物合成、茉莉酸類生物合成及MYB轉錄因子等。本研究利用轉錄組測序對SQ-1誘導的小麥生理型雄性不育五個發育時期花藥進行分析，結果發現，各時期共存在差異基因36 058個，涉及100多個代謝通路，其中大多數基因參與植物激素信號傳導、苯丙素生物合成、淀粉和蔗糖代謝、氨基酸的生物合成等途徑。說明SQ-1誘導的小麥生理型雄性不育花粉敗育機理涉及的基因更多，通路更廣，分子機理更為 復雜。

3.2 ABA信號通路與作物雄性不育

作物內源激素ABA含量變化與其雄性不育密切相關。Tang等[18]研究高溫誘導水稻花粉敗育機理時發現，隨著溫度的升高，水稻花粉育性降低，且花藥中ABA含量與對照相比顯著升高。Ji等[19]研究干旱誘導小麥花粉敗育時發現，可以通過降低花藥中ABA含量恢復花粉粒育性，表明調控小麥內源ABA可能會引起小麥生殖脅迫，進而誘發其雄性不育。本研究測定了CK-1376和PHYMS-1376五個時期花藥中ABA的含量，結果發現，與對照CK-1376相比，ABA含量在PHYMS-1376四分體至三核期花藥中含量均高于CK-1376，其中單核早期、單核晚期和二核期ABA含量均顯著高于對照(P<0.05)，上述結果表明，SQ-1誘導的小麥花粉敗育與花藥內源ABA含量升高密切相關。上述結果同樣在Ding等[20]研究三個白菜胞質雄性不育系中得到了 證實。

前人研究發現，PP2C、SnRk2蛋白與植物內源ABA信號轉導密切相關。植物內源ABA可以與PYR/PYL蛋白復合體結合使PP2C失活性，進而激活BIN2/BILs激酶，使SnRK2s磷酸化，進而調節下游蛋白，進一步促進ABA信號轉導與合成，相反PP2C可以作為負調控因子使SnRK2s去磷酸化，激活其與其他靶蛋白互作，進而抑制ABA信號傳導與合成[21-22]。本研究富集到PP2C的關鍵基因TraesCS1D02G271000，對其定量分析發現，該基因在CK-1376五個發育時期花藥中表達量均高于PHYMS-1376，且對照可育系五個發育時期花藥中ABA含量均低于PHYMS-1376。上述結果表明，SQ-1誘導小麥花粉敗育過程中，各時期花藥中PP2C關鍵基因TraesCS1D02G271000表達量過低，致使PP2C蛋白含量減少，進一步激活BIN2/BILs激酶，使SnRK2s磷酸化，促進ABA信號轉導與合成；另一個PP2C基因TraesCS3B02G266200定量結果表明，與對照CK-1376相比，四分體至單核早期，該基因在PHYMS-1376中的表達量顯著較高，單核晚期顯著低于對照，二核至三核期其表達量與對照無明顯差異。上述結果表明，不育系各時期花藥中TraesCS3B02G266200表達模式與ABA含量變化密切相關，但其表達模式不能完全支持PP2C蛋白負調控ABA信號轉導理論，說明TraesCS3B02G266200基因有可能還參與其他代謝途徑。SnRK2s基因TraesCS2A02G493800定量結果表明，與CK-1376相比，該基因在PHYMS-1376四分體至三核期花藥中表達量均顯著較高。上述結果表明，TraesCS2 A02G493800的過量表達及磷酸化，可以調節下游蛋白，促進ABA信號轉導與合成。這一研究結果在Yoo等[23]研究中也得到了證實。另兩個SnRK2s基因TraesCS4D02G210900及其等位基因表達模式也均支持SnRK2正向促進ABA信號轉導這一理論，但上述兩個基因的表達量在單核早期與這一理論相反，具體原因仍需要進一步研究。

3.3 JA信號通路與作物雄性不育

JA是一類重要的植物激素，參與了眾多的生理調控過程，有大量的研究表明，JA與植物雄性不育密切相關。Keller等[24]篩選獲得一株dde2-2的擬南芥突變株，表型為雄性不育，但外源噴施茉莉酸甲酯會促使花粉育性恢復，鑒定后發現，該擬南芥突變體主要是AOS基因突變。Joon-Hyun等[25]利用基因敲除技術，將擬南芥AOS基因敲除，同樣獲得了擬南芥雄性不育表型株，且內源JA含量非常低，但外施茉莉酸甲酯同樣可恢復其育性。Wang等[26]從雄性不育小麥中克隆出了茉莉酸合成途徑中重要差異表達基因TaOPR2，發現該基因表達模式可被外源茉莉酸甲酯誘導，表明TaOPR2與JA信號轉導及此類型小麥花粉敗育密切相關。本研究檢測了CK-1376和PHYMS-1376五個發育時期花藥中JA含量，結果發現，與CK-1376相比，JA含量在PHYMS-1376四分體、單核晚期及三核期花藥中顯著降低，在單核早期和二核期顯著升高(P<0.05)。上述結果表明，JA含量異常可能與SQ-1誘導小麥產生花粉敗育密切相關，除此以外JA還有可能參與其他生理代謝過程。

前人研究發現，JA信號轉導相關基因的激活主要由螺旋-環-螺旋轉錄因子MYC2(又稱JIN1)介導，當JA含量水平高時，JAZ蛋白被激素降解，當JA含量水平降低時，JAZ蛋白被激活，從而結合MYC2并且抑制其活性，之后MYC2再影響其他JA通路基因，且JA含量與JAZ相關基因表達之間存在負反饋調節[27-28]。本研究富集到JAZ基因TraesCS2A02G506500，定量結果發現，與對照CK-1376相比較，該基因表達量在PHYMS-1376單核晚期花藥中顯著增加，二核期和三核期表達量顯著降低，在四分體至單核早期表達量與對照無顯著性差異，推測TraesCS2A02G506500參與了JA信號轉導，但JA含量可能受TraesCS2A02G506500與其他基因共同調節；此外，另外2個JAZ基因TraesCS6B02G324300及其等位基因TraesCS6D02G274700表達量與CK-1376相比，在二核期這2個基因表達模式與JA含量呈負相關，進一步證實JA含量與JAZ基因表達之間存在負反饋調節這一結論。Cui等[29]研究發現，SA(水楊酸)的重要復合物EDS1(enhanced disease susceptibility 1)可以與PAD4結合形成異二聚體，從而抑制MYC2活性，且MYC2被證明與JAZ相關基因表達呈負調控關系，但同時也被證實是JA合成途徑中的關鍵正調控因子。上述結果表明，植物花藥內源JA含量異常變化，與花粉粒敗育密切相關，這一結果在Ye等[17]研究JA和MYB含量變化，誘發花粉壁不能正常形成，導致花粉敗育中得到證實。

4 結 論

與CK-1376比較，在PHYMS-1376五個發育時期花藥中共鑒定了36 058個差異表達基因，其中部分基因與植物激素信號轉導途徑相關性較高，檢測ABA和JA含量發現，ABA含量升高與SQ-1誘導的小麥花粉敗育密切相關，主要可能是因為不育系各時期花藥中PP2C關鍵基因TraesCS1D02G271000表達量過低，致使PP2C蛋白含量減少，進一步激活BIN2/BILs激酶，使SnRK2s磷酸化，促進ABA含量增加，進而誘導花粉敗育。不育系PHYMS-1376花藥中JA含量及其相關基因的異常表達也可能是參與誘導花粉敗育的主要因素。