TNF-α對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞自噬和增殖的影響及作用機制研究

汪吉烽 王維維 吳穎慧 羅晨栩 竇瑞玲 高玲 王國芬 莫選榮 羅心靜

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性炎癥性自身免疫疾病，其主要的病理特征是由于關節滑膜組織增生和炎癥而導致的軟骨及骨的損傷。RA患者關節組織中的滑膜成纖維細胞（rheumatoid arthritis synovial fibroblasts，RASF）是滑膜炎癥的主要效應細胞，其過度增殖造成的細胞數量異常增多是滑膜增生和骨質破壞的重要機制[1]。近年的研究表明，TNF-α、IL-1等炎癥因子誘導的RASF自噬上調是其凋亡抵抗和異常增殖的重要原因之一，并與RA滑膜增生密切相關[2]。因此調控RASF自噬所導致的滑膜增生已成為治療RA的有效策略[3]。NF-κB是在RA發病中起重要作用的炎癥信號通路之一，其在RA滑膜組織中高度活化，參與炎癥因子誘導的滑膜炎癥反應[4]。但其對炎癥因子誘導的RASF自噬的影響尚不太清楚。本研究擬以人類RASF細胞株MH7A作為載體，觀察TNF-α對RASF自噬和增殖的影響，并進一步通過抑制NF-κB通路來探討這一影響的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑 MH7A購自廣州吉妮歐公司；改良杜氏伊格爾培養基（DMEM）、FBS均購自美國Gibco公司；Bay11-7082購自美國MedChemExpress公司；總RNA分離試劑盒（Trizol）購自美國Applied Biosystems公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體購自美國GOOD HERE公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司；重組人TNF-α購自美國Novoprotein公司；噻唑藍法（MTT）試劑盒、熒光二抗、4，6-聯脒-2-苯基吲哚（DAPI）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒均購自南通碧云天公司；唯Bcl-2同源-3域蛋白-1（Beclin-1）兔單克隆抗體、磷酸化 NF-κB-p65（P-p65）兔單抗均購自美國Cell Signaling Technology公司；自噬相關基因微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ/自噬相關基因微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅰ（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）單抗、腺病毒-綠色熒光蛋白（Ad-GFP）-LC3-Ⅱ試劑、PCR試劑盒均購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 RASF傳代和培養 將MH7A用含10%FBS的DMEM培養液培養，每隔3～4 d換液1次，當細胞生長至融合度80%時用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3比例分瓶傳代并繼續培養。

1.2.2 實驗分組 在一階段實驗中，根據5 ng/ml TNF-α 處理時間不同，將細胞分為 6 組，即 0、3、6、12、24 及48 h組。在二階段實驗中，根據加入的藥物不同，將細胞分為4組，即5 μg/ml Bay11-7082預處理的Bay組，5 ng/ml TNF-α 預處理的 TNF-α 組，5 μg/ml Bay11-7082預處理2 h后再用5 ng/ml TNF-α預處理的Bay+TNF-α組，細胞不作處理的正常對照（Ctrl）組。

1.2.3 細胞增殖活性檢測 采用MTT法。將上述各組預處理細胞用胰酶消化并等量接種于96孔板，生長至一定密度加入20 μl MTT溶液，繼續培養4 h；終止培養后，小心吸去培養液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，搖床15 min，在492 nm波長處用酶標儀測量吸光度（OD）值。細胞相對活性=實驗組OD值/Ctrl組OD值×100%。

1.2.4 細胞中自噬小體形成情況檢測 共聚焦顯微鏡下采用GFP-LC3-Ⅱ來示蹤自噬形成。將上述各組預處理細胞用胰酶消化并接種于共聚焦培養皿，生長至一定密度后加入7.5 μl Ad-GFP-LC3-Ⅱ，繼續培育24 h；PBS漂洗，固定液靜置15 min；再經PBS漂洗后每孔加入80 μl的DAPI，避光搖床15 min；吸去染色液，PBS漂洗3遍；在共聚焦顯微鏡下觀察外源性GFP-LC3-Ⅱ在細胞定位，分析細胞中自噬小體的形成情況。

1.2.5 P-p65、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和 Beclin-1蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。將上述各組預處理細胞用PBS緩沖液漂洗3次，加入蛋白裂解液冰上混勻裂解30 min，離心取上清液，采用BCA法測出蛋白濃度；將 20 μg蛋白樣品與6×SDS加樣緩沖液混合上樣；樣品經10%SDS-PAGE電泳分離后，經電轉移法轉移到PVDF膜上，室溫下封閉4 h；分別加入GAPDH、P-p65、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1兔多克隆抗體，孵育過夜；隔日漂洗后，加入HRP標記的羊抗兔IgG，反應1 h；加入ECL試劑，曝光成像并灰度掃描分析。GAPDH為內參照物。

1.2.6 Beclin-1 mRNA的表達水平檢測 采用real-time PCR法。用Trizol法提取RNA，將提取后的RNA經逆轉錄制備 cDNA，反應體系如下：1 μg RNA、40 U/μl莫羅尼小鼠白血病病毒逆轉錄酶、100 nmol/L多聚胸腺嘧啶、1 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸混合物、0.1 mol/二硫蘇糖醇、40 U/μl RNA酶抑制物、加焦碳酸二乙酯去離子水至總體積為20 μl。反應條件如下：42℃60 min，70℃10 min。將生成的cDNA進行PCR擴增，反應體系如下：0.4 μmol/L cDNA、1 μl正、反義鏈 12.5 μl SYBR Green酶、加去離子水至總體積20 μl。PCR反應程序如下：95℃5 min預變性，然后按95℃15 s，60℃1 min共40個循環，最后72℃7 min延伸。計算模板與對照樣本之間的2－ΔΔCt值差。

1.2.7 P-p65在細胞中表達及定位檢測 采用細胞免疫熒光法。將將上述各組預處理細胞用胰酶消化并等量移至細胞爬片；入封固液1 h。加入NF-κB p65，4℃過夜，隔日用PBS清洗3次，加入羊抗兔IgG室溫下搖床2 h。用DAPI（1∶1 000）染核（全程避光），用PBS漂洗3次，在新的載玻片上滴加淬滅液，置于熒光倒置顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 不同時間6組細胞相對活性比較 與0 h組相比，12、24、48 h組細胞相對活性均明顯升高（均P＜0.05），見表 1。

表1 不同時間6組細胞相對活性比較（%）

2.2 不同時間6組自噬小體形成情況比較 GFPLC3-Ⅱ腺病毒轉染細胞后，與0 h組相比，TNF-α刺激滑膜細胞后自噬小體形成明顯增多，其中24 h組最為明顯，見圖1（插頁）。

圖1 不同時間6組細胞TNF-α刺激后自噬小體形成共聚集顯微鏡下所見（×200）

2.3 不同時間6組細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1蛋白表達水平比較 與0 h組相比，3、6、12 h組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平均明顯升高，差異均有統計學意義（均 P＜0.05），6、12、24、48 h 組 Beclin-1 蛋白表達水平均明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖2、表2。

表2 不同時間6組細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表達水平比較

圖2 不同時間6組細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1蛋白表達的電泳圖（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ為自噬相關基因微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ/自噬相關基因微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅰ；Beclin-1為唯Bcl-2同源-3域蛋白-1）

2.4 不同時間6組細胞Beclin-1 mRNA表達水平比較 與 0 h 組相比，6、12、24、48 h 組 Beclin-1 mRNA表達水平均明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表3。

表3 不同時間6組細胞Beclin-1 mRNA表達水平比較

2.5 不同藥物預處理4組細胞P-p65蛋白表達及染核情況比較 與TNF-α組相比，Bay+TNF-α組細胞內P-p65蛋白表達及染核明顯減少，見圖3（插頁）。與Ctrl組比較，Bay組細胞P-p65蛋白的表達水平明顯下降，與TNF-α組比較，Bay+TNF-α組細胞P-p65蛋白的表達水平明顯下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖4。

圖3 不同藥物預處理4組細胞NF-κB染核情況熒光顯微鏡下所見（P-p65為磷酸化NF-κB-p65；DAPI染色，×200）

圖4 不同藥物預處理4組細胞P-p65蛋白表達的電泳圖（P-p65為磷酸化 NF-κB-p65）

2.6 不同藥物預處理4組細胞相對活性比較 與Ctrl組比較，Bay組細胞相對活性明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與 TNF-α 組比較，Bay+TNF-α 組細胞相對活性明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 不同藥物預處理4組細胞相對活性比較（%）

2.7 不同藥物預處理4組細胞自噬小體形成情況比較 與TNF-α組相比，Bay+TNF-α組細胞自噬小體明顯減少，見圖5（插頁）。

圖5 不同藥物預處理4組細胞自噬小體形成共聚集顯微鏡下所見（×200）

2.8 不同藥物預處理4組細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1蛋白表達水平比較 與Ctrl組比較，Bay組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表達水平均明顯下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與TNF-α組比較，Bay+TNF-α組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表達水平均明顯下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖6、表5。

圖6 不同藥物預處理4組細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表達的電泳圖（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ為自噬相關基因微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ/自噬相關基因微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅰ；Beclin-1為唯Bcl-2同源-3域蛋白-1）

表5 不同藥物預處理4組細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表達水平比較

2.9 不同藥物預處理4組Beclin-1 mRNA表達水平比較 與Ctrl組比較，Bay組Beclin-1 mRNA表達水平明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與TNF-α組比較，Bay+TNF-α組Beclin-1 mRNA表達水平明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見表6。

表6 不同藥物預處理4組細胞Beclin-1 mRNA表達水平比較

3 討論

RA病變的一個重要特征就是由于滑膜組織的增生所導致的關節軟骨及骨的侵蝕破壞。研究表明RASF是引起關節滑膜組織增生的關鍵效應細胞。RASF與正常滑膜細胞不同，在炎癥因子（如TNF-α、IL-1）等刺激下，其細胞表型及生物學行為均發生顯著變化，具有“腫瘤樣”生長和侵襲特性，能逃避正常的生長調控機制而出現大量增殖，并合成和分泌多種炎性細胞因子、趨化因子和基質金屬蛋白酶，導致慢性滑膜炎，形成血管翳并侵蝕軟骨和軟骨下骨[5]。如果能夠有效抑制RASF活化和異常增殖，將能阻斷滑膜增生和骨質侵蝕，從而使RA的病變得到有效的控制。然而，RASF異常增殖的機制十分復雜，目前尚不明確。

近年來研究結果表明，RASF自噬參與RA滑膜增生病變過程[6-8]。RASF自噬上調是RASF凋亡抵抗及過度增殖的重要機制，在RA滑膜增生和關節破壞中起著重要作用。某些在RA病變中起重要作用的炎癥因子（如 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17等）在 RASF自噬產生過程中發揮著重要作用[9]。如TNF-α不僅能誘導RASF凋亡抵抗，還能誘導RASF的自噬，故其已被廣泛用作RA的治療靶標[10-11]。本研究一階段實驗結果證實，RASF受TNF-α刺激后細胞增殖活性顯著增加，同時自噬細胞數及自噬標志性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平升高，提示TNF-α能誘導RASF自噬，并且與細胞增殖相關。Beclin-1是酵母自噬相關基因Atg6的同源物，屬于Bcl-2抗癌基因家族，其不但參與細胞凋亡調節，而且參與細胞自噬的調控。本研究發現，TNF-α刺激RASF后Beclin-1 mRNA和蛋白表達水平均升高，表明Beclin-1參與TNF-α誘導RASF自噬過程，可能與RA病變有關。

目前NF-κB通路是與RA發病關系最為明確的信號轉導通路。研究表明，NF-κB介導RASF活化及多種炎癥細胞因子的生成調節[12]。NF-κB也是RASF存活的關鍵調節因子，參與RA滑膜增生的發病機制[4]。本研究二階段實驗中，采用NF-κB通路抑制劑BAY11-7082來抑制NF-κB通路活化，觀察TNF-α刺激下的RASF增殖和自噬的變化，結果顯示，抑制NF-κB通路活化能顯著降低基礎狀態和TNF-α刺激下的RASF增殖和自噬水平，同時Beclin-1基因表達顯著降低。以上研究提示，NF-κB通路活化介導了TNF-α誘導的RASF自噬和增殖活性，并且可能與其上調Beclin-1表達有關。有研究報道抑制NF-κB活化能明顯抑制RASF增殖并促進凋亡[4]。而NF-κB通路是否通過上調RASF自噬促進其凋亡抵抗及其過度增殖，尚需要進一步研究。

綜上所述，本實驗表明TNF-α能誘導RASF自噬和增殖活性，其機制與其激活NF-κB通路活化有關。因此，靶向NF-κB介導的RASF自噬的調控，可能成為有效防治RA的新靶點。