沉默EpCAM表達對膽囊癌細胞增殖和遷移的影響

鄔仲鑫 蔡煒龍 尹磊

膽囊癌起源于膽道上皮細胞，是膽道系統最常見的惡性腫瘤[1-2]，在我國其發病率逐年增加。由于膽囊癌早期缺乏明顯和特殊的臨床癥狀，且易轉移，因此大多數患者明確診斷時已處于腫瘤中晚期。目前，根治性切除是膽囊癌唯一有效的治療方法，但其根治性（R0）切除率低[3]。膽囊癌對放化療效果不顯著，尚無有效的靶向治療或免疫治療方案，因此預后極差，患者平均生存時間只有5.2～24.4個月，且近年來，膽囊癌患者的5年相對生存率持續下降[4]。因此，目前亟待了解膽囊癌發生、發展的相關機制并研制出針對性較強的分子靶向治療藥物[5]。上皮細胞黏附分子（EpCAM）是一種分子量為40 kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其通過參與細胞核信號傳導、介導腫瘤細胞遷移、增殖和分化等過程，在腫瘤的發生和遠處轉移中發揮重要作用。大量研究表明，EpCAM在結腸癌、肺癌、胃癌等腫瘤中呈高表達[6]，且抗EpCAM靶向藥物已用于治療惡性腹腔積液[7]。然而有關EpCAM在膽囊癌中的作用研究很少，因此本研究探討沉默EpCAM表達對膽囊癌細胞增殖和遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 人膽囊癌細胞株（EH-GB1、EH-GB2、GBC-SD、NOZ、OCUG-1、SGC-996）由中國科學院上海生命研究院細胞資源中心提供。DMEM培養基、William′s培養基、RPMI1640培養基、Opti-MEM培養基和FBS均購自美國Gibco公司；鏈霉素-青霉素雙抗購自上海翊圣有限公司；小干擾RNA si-NC和si-EpCAM（5′-CUAC AAGCUGGCCGUAAACdTdT-3′）、EpCAM引物均由上海拓然生物科技有限公司合成；脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒、多聚甲醛、結晶紫均購自上海碧云天生物科技有限公司。反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購自大連Takara公司；酶標儀（BIORAD，IMARK）購自美國伯樂公司；顯微鏡（OLYMPUS，cx23）購自中國奧林巴斯有限公司。

1.2 細胞培養 將人膽囊癌細胞株置于5%CO2和37℃的培養箱中，分別用含10%FBS和100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的培養基培養。EH-GB1、EH-GB2、GBC-SD和OCUG-1細胞株使用DMEM培養基，NOZ細胞株使用William培養基，SGC-996細胞株使用RPMI1640培養基。細胞常規置于100 mm培養皿中，于生長對數期時使用胰蛋白酶-EDTA消化并收集。

1.3 細胞分組和轉染 將人膽囊癌細胞株NOZ和GBC-SD分為實驗組（si-EpCAM組）、對照組（si-NC組）和空白組（Control組），其中si-EpCAM組細胞轉染si-EpCAM，si-NC組細胞轉染si-NC，Control組細胞不添加小干擾RNA。將NOZ和GBC-SD細胞株接種于6孔板內，待長至30%～50%左右時進行轉染。轉染過程按照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書進行，即用250 μl Opti-MEM培養基培養液分別稀釋10 μl 20 μmol/L的siRNA儲存液和5 μl lipo2000，混勻并室溫孵育5 min后將兩者混合，室溫孵育20 min，加入到含有1 500 μl Opti-MEM培養基的6孔板內。轉染6 h后，更換新鮮培養基。待48 h后收集人膽囊癌細胞株進行后續實驗。

1.4 EpCAM的mRNA相對表達量檢測 采用qRTPCR法。轉染后的細胞中加入1 ml Trizol提取總RNA，檢測RNA的濃度和純度。按mRNA反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，qRT-PCR反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s；60℃退火延伸34 s，共40個循環。引物序列如下：上游：5′-AATCGTCAATGCCAGTGTACTT-3′；下游：5′-TCTCATCGCAGTCAGGATCATAA-3′。其相對表達量采用 2-ΔΔCt法計算。

1.5 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。轉染后的細胞常規消化、離心、重懸后計數，將細胞接種于96孔板中，GBC-SD 細胞每孔 0.8×103個，NOZ 細胞每孔 1×103個，每組設置5個復孔。將96孔板置于37°C、5%CO2培養箱中，分別于1、2、3、4 d加入培養液與CCK-8按9∶1 混合的反應液 100 μl/孔，37 ℃避光培養 3～4 h 后取出，使用酶標儀檢測450 nm處的吸光度（OD）值來表示細胞增殖能力，并繪制細胞生長曲線。上述實驗重復3次，取平均值。

1.6 細胞克隆能力檢測 采用克隆形成實驗。轉染后的細胞常規胰酶消化、離心、重懸后計數，將細胞分別接種于3 cm培養皿中，每孔1 000個細胞，每組設置3個復孔，置于37°C、5%CO2培養箱中。持續2周，定期換液隨時檢查，到細胞形成克隆時終止培養，染色觀察克隆數量。每孔加入1 ml 4%多聚甲醛固定后以結晶紫染色。拍照并采用Image J軟件進行計數。上述實驗重復3次，取平均值。

1.7 細胞遷移能力檢測 采用Transwell小室實驗。轉染后的細胞常規胰酶消化、離心、重懸后計數。用無血清培養基調整細胞密度至5×105/ml。取200 μl細胞懸液加于上層小室，下室加入500 μl 10%FBS的完全培養基，放置在37°C、5%CO2培養箱內，培養24～48 h后取出Transwell小室，去除小室上清液，用PBS沖洗，多聚甲醛固定20 min后，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，結晶紫染色20 min，PBS沖洗。顯微鏡下觀察和計數5個不同視野的細胞遷移數。上述實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 6株及3組細胞EpCAM的mRNA相對表達量比較 6株細胞中，NOZ和GBC-SD細胞株EpCAM的mRNA相對表達量相對較高，SGC-996細胞株最低，見圖1；而在NOZ和GBC-SD細胞株中，si-EpCAM組Ep－CAM的mRNA相對表達量均明顯低于si-NC組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 3組NOZ和GBC-SD細胞EpCAM的mRNA相對表達量比較

圖1 6株膽囊癌細胞EpCAM的mRNA相對表達量比較（EpCAM為上皮細胞黏附分子）

2.2 3組細胞增殖能力比較 加入CCK-8后第4天，NOZ和GBC-SD細胞株中，與si-NC組比較，si-EpCAM組細胞OD值均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見圖 2。

圖2 3組NOZ和GBC-SD細胞增殖能力比較（OD為吸光度；*P＜0.05）

2.3 3組NOZ和GBC-SD細胞克隆能力比較 NOZ和GBC-SD細胞株中，si-EpCAM組細胞的克隆形成數均明顯少于si-NC組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見圖3（插頁）、表2。

圖3 3組NOZ和GBC-SD細胞克隆能力比較（EpCAM為上皮細胞黏附分子）

表2 3組NOZ和GBC-SD細胞克隆形成數比較

2.4 3組NOZ和GBC-SD細胞遷移能力比較 NOZ和GBC-SD細胞株中，與si-NC組比較，si-EpCAM組中細胞遷移數均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見圖4（插頁）、表3。

圖4 3組NOZ和GBC-SD細胞遷移能力比較（EpCAM為上皮細胞黏附分子；結晶紫染色，×100）

表3 3組NOZ和GBC-SD細胞遷移數比較

3 討論

膽囊癌惡性程度較高，病程進展迅速，缺乏有效治療手段，且發病率呈現逐年升高的趨勢。近幾十年來關于膽囊癌的研究有了一定的進展，但早期診斷和采取合適的治療方法仍是改善本病預后的主要途徑。然而，膽囊癌高轉移、高侵襲特性的分子機制尚未被完全闡明，并且用于膽囊癌診斷的腫瘤分子標志物特異性較差，遠不能為膽囊癌的早期診斷提供分子靶標。

EpCAM最早于1979年在結腸癌中發現，是一種嗜同種非鈣離子依賴性上皮細胞黏附分子。除了在細胞間黏附中發揮作用外，相關體內外實驗還表明，EpCAM在細胞信號傳導，增殖及分化中起著重要作用[8]。EpCAM在上皮起源的腫瘤中有著異常的高表達水平，在結直腸癌、肝癌等多種腫瘤中作為篩選腫瘤干細胞的標志物[9-10]；也可作為在腫瘤進展和轉移過程中治療和預后的標志物[11-12]。EpCAM的預后價值在不同腫瘤中有所差別，在乳腺癌[13]、結直腸癌[14]、前列腺癌[15]、胰腺癌[16]等中，高表達和預后不良呈正相關；而在食管癌[17]、胃癌[18]、甲狀腺癌[19]等中，高表達和預后不良呈負相關。因此，EpCAM與不同臨床結果之間的關系是復雜的，可能與腫瘤的起源或腫瘤進展的階段相關，其相關機制還需要進一步的研究。

Varga等[20]發現，EpCAM高表達是膽囊癌不良預后的獨立危險因素。本研究初步探討了EpCAM在膽囊癌細胞NOZ和GBC-SD中對其增殖和轉移功能的影響，為今后進一步的機制研究奠定基礎。EpCAM作為上皮細胞黏附分子，在細胞間連接和癌細胞侵襲轉移中具有重要作用。本研究首先在6株膽囊癌細胞系中檢測了EpCAM的mRNA相對表達量，結果發現，在NOZ和GBC-SD中EpCAM的相對表達量較高，可能與NOZ和GBC-SD本身具有較強的遷移能力相關；而在SGC-996中，EpCAM幾乎沒有表達，也提示可能與SGC-996較弱的遷移能力有關（關于膽囊癌細胞的遷移能力數據尚未發表）。在Transwell實驗中，敲減EpCAM的表達明顯抑制了NOZ和GBC-SD的遷移能力，證明了EpCAM的確在膽囊癌細胞的遷移中發揮了重要作用，其相關機制還需要進一步研究，在膽囊癌中是否與腫瘤轉移有關也有待探索。此外，本研究應用CCK-8實驗和克隆形成實驗驗證了敲減EpCAM的表達可抑制NOZ和GBCSD的增殖能力，說明EpCAM在膽囊癌細胞的增殖方面也發揮了作用。

綜上所述，EpCAM可能通過促進膽囊癌細胞的增殖和遷移能力從而促進膽囊癌的發生、發展及轉移。EpCAM可考慮作為篩選腫瘤干細胞的標志物，也可作為診斷和治療膽囊癌的分子靶點。但其調控膽囊癌細胞功能的具體機制以及在臨床中的應用仍需進一步探索。