miR-601在胃癌中的表達及其對胃癌細胞凋亡、侵襲的影響

王石健 陳旭麗

胃癌是全球第5大常見的惡性腫瘤，也是第3大癌癥死亡原因，每年約有723 000例胃癌患者死亡[1]，且大多數(shù)患者首次發(fā)現(xiàn)時已處于晚期。盡管晚期胃癌可通過手術(shù)和（或）化學療法治療，但患者總體5年生存率仍不到24%[2-3]。胃癌的特征是致癌基因發(fā)生了多種遺傳和表觀遺傳學改變，這些改變擾亂了關(guān)鍵基因的表達[4-5]。然而，胃癌發(fā)生、發(fā)展的確切分子機制尚未完全闡明，因此發(fā)現(xiàn)潛在胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物標志物具有重要的意義。miRNA是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA分子，可通過與mRNA的3′-非翻譯區(qū)結(jié)合從而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達[6]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-601與前列腺癌、食管鱗狀細胞癌、肝癌、胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7-10]。目前，miR-601在胃癌中的研究不多，miR-601如何介導胃癌的發(fā)生、發(fā)展需要進一步研究[11]。本文將探討miR-601在胃癌中的表達及其對胃癌細胞凋亡、侵襲的影響。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年8月至2019年8月臺州市立醫(yī)院收治的經(jīng)病理學檢查確診為胃癌的30例患者的癌組織及相應癌旁（距離腫瘤≥2 cm）正常組織標本。納入標準：（1）患者術(shù)前未進行放、化療等手段治療；（2）患者未患有其他重大疾病。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者及家屬均知情同意。

1.2 材料和試劑 人胃癌細胞株AGS、HGC-27、MGC-803和正常胃細胞株GES-1均購自中科院上海細胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司（批號：A4192301）；噻唑藍（MTT）粉末購自上海碧云天有限公司（批號：ST1537）；引物由上海生工生物工程公司合成；RNA提取試劑TRIzol、real-time PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Lipofectamine 3000均購自美國Invitrogen公司（批號：15596018、A28138、12594100 及 L3000001）；miR-601抑制物（miR-601 inhibitor）和陰性對照序列（inhibitor NC）均由上海吉瑪基因公司設計合成；AnnexinV-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司（批號：SY0478）；Transwell小室購自美國Corning公司（批號：354480）；基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、GADPH抗體均購自英國Abcam公司（批號：ab92536、ab76003及 ab9485）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將人胃癌細胞株AGS、HGC-27、MGC-80、正常胃細胞株GES-1用含10%FBS和1%鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組 將AGS細胞按照3×105個細胞/孔接種在6孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，當細胞融合為一層時進行細胞轉(zhuǎn)染。用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000將miR-601 inhibitor和inhibitor NC轉(zhuǎn)染AGS細胞，并分為miR-601 inhibitor組和inhibitor NC組。具體操作嚴格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行。轉(zhuǎn)染48 h后收集總RNA，進行后續(xù)的實驗檢測。

1.3.3 miR-601相對表達量檢測 采用qRT-PCR法。采用TRIzol提取總RNA，以RNA為模板，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成，按照real-time PCR試劑盒的說明書進行反應，擴增miR-601。定量PCR條件：95℃，10 min（1 個循環(huán)），95 ℃、15 s，60 ℃、60 s（40 個循環(huán)），95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。引物序列：miR-601-F：5′-CACTAGATTGTGAGCTCCTGGA-3′，miR-601-R 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；GAPDH-F：5′-TCAA －GAAGGTGGTGAAGCAGG-3′，GAPDH-R：5′-TCAAAG GTGGAGGAGTGGGT-3′。U6為內(nèi)參照，以miR-60與U6拷貝數(shù)的比值為 miR-601相對表達量，采用2-ΔΔCt法進行計算。

1.3.4 細胞抑制率檢測 采用MTT法。將轉(zhuǎn)染后的AGS細胞按照2×103個細胞/孔接種于96孔板中，分別在24、48和72 h時每孔加入MTT溶液，再培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)上清液，加入150 μl DMSO，室溫振蕩5 min溶解甲臜結(jié)晶，在波長490 nm處用酶標儀檢測相應的吸光度值（OD值），計算細胞抑制率，細胞抑制率=1－miR-601 inhibitor組OD值/inhibitor NC組OD值×100%。

1.3.5 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術(shù)。將轉(zhuǎn)染后的AGS細胞按照3×105個/孔接種在6孔板中培養(yǎng)，收集細胞上清液，PBS清洗后加入不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，收集細胞，于4℃下1 100 r/min離心5 min，重懸細胞后加入流式管。流式管避光加入5 μl AnnexinV-APC染色10 min，再加入5 μl 7-AAD染色5 min，用流式細胞儀進行收集檢測。

1.3.6 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗。將轉(zhuǎn)染后的AGS細胞按照3×105個細胞/孔接種在6孔板中培養(yǎng)，并繼續(xù)培養(yǎng)孵育至生長為80%左右，用200 μl無菌移液器槍頭每孔垂直劃3條平行線；棄培養(yǎng)基，PBS洗滌，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，拍照時用PBS緩沖液代替培養(yǎng)基，隨機取10個視野，在0 h和24 h通過倒置顯微鏡拍攝，計算細胞遷移率，細胞遷移率=（0 h劃痕寬度－培養(yǎng)后劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.3.7 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell小室實驗。將事先液化的Matrigel用無血清RPMI1640培養(yǎng)基1∶6比例稀釋，取100 μl轉(zhuǎn)染后的AGS細胞加入上層Transwell小室，37℃使其固化，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出小室后用棉簽拭去上層小室未遷移的細胞，甲醇固定細胞，結(jié)晶紫染色，隨機取10個視野，通過倒置顯微鏡拍攝，計算細胞侵襲數(shù)。

1.3.8 MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量檢測 采用Western blot法。將轉(zhuǎn)染后的AGS細胞按照3×105個/孔接種在6孔板中培養(yǎng)，加入細胞裂解液裂解，離心收集細胞裂解液。制備分離膠和濃縮膠，蛋白上樣電泳，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉，加入一抗再孵育24 h，然后加入二抗再室溫孵育2 h，顯影曝光。使用軟件分析蛋白條帶，計算蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 不同組織或細胞中miR-601相對表達量比較 與癌旁正常組織比較，胃癌組織中miR-601相對表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與GES-1比較，其余3株胃癌細胞miR-601相對表達量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與inhibitor NC組比較，miR-601 inhibitor組miR-601相對表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1～3。

表1 胃癌組織和癌旁正常組織中miR-601相對表達量比較

表2 不同細胞株中miR-601相對表達量比較

表3 兩組細胞中miR-601相對表達量比較

2.2 兩組細胞抑制率比較 結(jié)果顯示與inhibitor NC組相比，轉(zhuǎn)染 miR-601 inhibitor后 24、48、72 h時 miR-601 inhibitor組細胞抑制率均較低，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.05），見圖 1。

圖1 兩組細胞抑制率比較（與inhibitor NC組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3兩組細胞凋亡率比較 與inhibitor NC組比較，miR-601 inhibitor組的細胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖 2、表 4。

圖2 兩組細胞凋亡率的流式細胞圖

表4 兩組細胞凋亡率比較（%）

2.4 兩組細胞細胞遷移率和細胞侵襲數(shù)比較 與inhibitor NC組比較，miR-601 inhibitor組的細胞遷移率明顯升高，而細胞侵襲數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.05），見圖 3、表5和圖4（插頁）、表6。

表5 兩組細胞遷移率比較（%）

表6 兩組細胞侵襲數(shù)比較（個）

圖3 兩組細胞劃痕實驗圖

圖4 兩組細胞侵襲數(shù)比較（結(jié)晶紫染色，×200）

2.5 兩組細胞MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量比較與inhibitor NC組比較，miR-601 inhibitor組MMP-2和MMP-9蛋白相對表達量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖 5和表7。

表7 兩組細胞MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量比較

圖5 兩組細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達電泳圖（MMP為基質(zhì)金屬蛋白酶）

3 討論

胃癌是人類消化系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率逐年上升[1]。鑒定具有高靈敏度和特異度的腫瘤標志物對于早期胃癌的臨床篩查非常重要。越來越多的研究證明，抑癌基因或癌基因異常表達都會介導胃癌的發(fā)生和發(fā)展[7]。因此，探索有潛力的抑癌基因?qū)τ谖赴┭芯窟M展具有重要的臨床意義。

近年來，已在胃癌的腫瘤樣本中廣泛檢測到miRNA的異常表達，并發(fā)現(xiàn)這些miRNA在胃癌進展過程中發(fā)揮重要作用。Qiu等[12]的研究結(jié)果表明miR-671-5p在胃癌中處于低表達水平，但miR-671-5p過表達后能夠通過靶向細胞增殖上調(diào)因子抑制胃癌細胞增殖。還有研究發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中miR-376a呈低表達，且miR-376a與胃癌患者的生存密切相關(guān)[13]。因此，探討miRNA的臨床和功能作用仍具有重要意義，可為胃癌提供有效的治療方法。

miR-601是miRNA家族的重要成員，已在多種人類癌癥中檢測到miR-601的異常表達。但是miR-601作為癌基因或抑癌基因的作用隨癌癥類型而不同。例如，研究發(fā)現(xiàn)miR-601在在肝癌組織和細胞系中的表達顯著下調(diào)，進一步的實驗表明miR-601可能通過直接靶向結(jié)合磷脂酰肌醇3激酶調(diào)節(jié)亞基3和調(diào)節(jié)蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路來抑制肝癌的進展[9]。Cao等[10]也證明了miR-601在胰腺癌組織中表達明顯下調(diào)，且發(fā)現(xiàn)miR-601可能抑制Sirtuin1的表達參與胰腺癌的進展。但Scheffer等[14]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-601在膀胱癌組織中的表達水平上調(diào)。最新的研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA人類同源盒基因轉(zhuǎn)錄反義間RNA可通過介導miR-601靶向鋅指轉(zhuǎn)錄因子促進乳腺癌的發(fā)展[15]。但miR-601是如何介導胃癌的發(fā)展目前尚不明確。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-601在胃癌組織中表達升高，且進一步發(fā)現(xiàn)相對于正常胃細胞GES-1，miR-601在胃癌細胞株AGS、HGC-27、MGC-803表達升高，這與Min等[11]的結(jié)果相一致。以上組織學及細胞學水平的檢測結(jié)果均證實，miR-601在胃癌中表達升高，初步提示miR-601可能是胃癌的的促癌基因，抑制miR-601的表達可以抑制胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

本文的實驗結(jié)果表明，當AGS細胞轉(zhuǎn)染miR-601 inhibitor后，AGS細胞中的miR-601的表達降低；同時發(fā)現(xiàn)抑制miR-601的表達后，AGS細胞的生長受到抑制，說明miR-601參與了胃癌細胞的生長。目前，有大量研究發(fā)現(xiàn)miRNAs與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的密切相關(guān)。例如，miR-519d可通過靶向結(jié)合人表皮生長因子受體3抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[16]。miR-216B在人類皮膚鱗狀細胞癌中表達降低，但miR-216B表達上調(diào)后能夠通過下調(diào)Xklp2靶蛋白表達從而抑制皮膚鱗狀癌細胞的增殖、侵襲和遷移[17]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-601也可介導胃癌的侵襲和遷移。細胞劃痕實驗發(fā)現(xiàn)，當AGS細胞轉(zhuǎn)染miR-601 inhibitor后，AGS細胞的遷移能力明顯降低；同時，Transwell小室實驗檢測發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-601后，胃癌細胞AGS侵襲能力也明顯下降。MMP-2和MMP-9是MMPs的成員，它們與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移關(guān)系最為緊密[18]，進一步行Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-601表達后，MMP-2和MMP-9的表達降低，說明了miR-601可通過降低MMP-2和MMP-9的表達介導胃癌的侵襲和遷移。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)miR-601在胃癌組織和細胞中表達升高，且抑制miR-601表達后能夠抑制胃癌細胞的生長、侵襲和遷移，但miR-601上下游的靶基因和細胞通路仍然不清楚，需要后續(xù)實驗的進一步研究。