Hsulf-1介導PI3K/AKT信號通路抑制肝癌細胞侵襲轉移的作用機制研究

劉凌 沈偉敏 郭琦琪

肝癌（hepatic carcinoma）是我國最常見的惡性腫瘤之一。我國每年因原發性肝癌死亡42.2萬例，約占全球50%，其不良預后與早期轉移及復發有關，因此研究肝癌的侵襲轉移機制至關重要[1-3]。本研究團隊在前期研究中發現，肝癌組織中人硫酸酯酶-1（Hsulf-1）mRNA和蛋白表達水平較癌旁組織均明顯降低，且在肝癌細胞系HepG2、SMMC7221等中Huslf-1表達較正常細胞系LO2低，提示Hsulf-1與肝癌細胞生長、侵襲轉移關系密切，然而Hsulf-1在肝癌細胞侵襲轉移中的具體作用機制仍不甚明確[4-5]。此外目前已有大量研究發現磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B（PI3K/AKT）信號通路與肝癌的發生、發展相關[6-9]。因此本研究將進一步探討Hsulf-1介導PI3K/AKT信號通路抑制肝癌細胞侵襲轉移的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 肝癌細胞系SMMC7221細胞購自上海中國科學院細胞庫；pcDNA 3.1（+）-Hsulf-1、Hsulf-1 siRNA質粒均購自上海吉瑪制藥技術有限公司。TaKaRa RNA PCR KIT（AMV）Ver.3.0試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司；內參GAPDH、上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）、β-連環蛋白（β-catenin）基因引物均購自上海生工生物工程有限公司，一抗購自北京博奧森生物技術有限公司，二抗購自美國馬里蘭州KPL公司；Trizol試劑、DMEM、G418、FBS、細胞裂解液、LY294002、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL試劑盒、質粒DNA小量提取試劑盒、LipofectamineTM2000試劑均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 細胞培養、轉染及分組 采用胰蛋白酶消化生長狀態良好的SMMC7221細胞，計數后分別接種于24孔細胞培養板上，待細胞生長至70%～80%時，嚴格按照LipofectamineTM2000試劑盒操作說明書進行轉染，分為Hsulf-1過表達組、Hsulf-1 siRNA組、抑制劑組和空白組。Hsulf-1過表達組：將 pcDNA 3.1（+）-Hsulf-1質粒轉染至SMMC7221細胞中，在細胞培養箱中轉染 6 h后更換培養基繼續培養；Hsulf-1 siRNA組：成功構建的Hsulf-1 siRNA按照LipofectamineTM2000試劑盒操作說明書，轉染至SMMC7221細胞中；抑制劑組：SMMC7221細胞加入AKT抑制劑LY294002；空白組：培養良好的SMMC7221細胞，不作其他處理。

1.3 E-cadherin和β-catenin mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法，用Trizol試劑提取細胞總RNA，接著測定RNA純度及含量。根據GeneBank設計引物，后者作為內參照。E-cadherin的上游引物:5′-TGAAGGTGACAG AGCCTCTGGAT-3′，下游引物：5′-TGGGTGAATTCGG GCTTGTT-3′；β-catenin 的上游引物：5′-AAGGTCTGAG GAGCAGCTTC-3′，下游引物：5′-TGGACCATAACTGCA GCCTT-3′；內參照 GAPDH 的上游引物：5′-AGTCAAC GGATTTGGTCGT-3′，下游引物：5′-TTGATTTTGGAGG GATCTG-3′。嚴格按照 TaKaRa RNA PCR KIT（AMV）Ver.3.0試劑盒操作說明書進行相關步驟操作，最終反應產物使用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，在染色后使用凝膠成像系統進行照相并定量分析。

1.4 Hsulf-1、磷酸化 AKT（p-AKT）、E-cadherin 和 βcatenin蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。細胞轉染24 h后，通過細胞裂解液來裂解細胞，并提取蛋白，采用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定相關蛋白濃度，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后再轉印硝酸纖維素薄膜（PVDF）上，在用封閉液稀釋一抗后（包括Hsulf-1、p-AKT、E-cadherin 以及 β-catenin）過夜，PBST漂洗后，再浸洗3次，每次5 min，加入二抗4℃下1 h，漂洗后吸干，應用ECL發光試劑盒進行結果的顯影顯色，標定Marker后拍照分析，并以β-actin作為內參照。

1.5 細胞遷移能力檢測 采用Transwell小室實驗法。將轉染pcDNA 3.1（+）-Hsulf-1質粒后的Hsulf-1過表達組、Hsulf-1 siRNA組、抑制劑組（加入10 μmol/L LY294002）以及空白組SMMC7221細胞用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風干。對數生長期的細胞用2 mol/L乙二胺四乙酸//PBS緩沖液消化，PBS洗滌1次，用無血清0.1%BSADMEM重懸成單細胞懸液，調整細胞密度為1×105/ml。每孔200 μl細胞懸液均勻接種于上室，下室加入5%FBS-DMEM培養基 500 μl，在 37 ℃，5%CO2細胞培養箱培養24 h，取出后PBS洗，并用棉簽去除上室的表面細胞以及Matrigel凝膠，然后下室細胞使用4%多聚甲醇進行固定，染色后PBS洗兩遍，并于光學顯微鏡下觀察，隨機選擇5個視野計算遷移細胞數平均值。

2 結果

2.1 各組E-cadherin和β-catenin mRNA表達水平比較 Hsulf-1過表達組E-cadherin和β-catenin mRNA表達水平均明顯高于空白組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；Hsulf-1 siRNA組、抑制劑組 E-cadherin和β-catenin mRNA表達水平均明顯低于空白組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 各組E-cadherin和β-catenin mRNA表達水平比較

圖1 各組E-cadherin和β-cateninmRNA表達的電泳圖（E-cadherin為上皮鈣黏蛋白；β-catenin為β-連環蛋白；a：Hsulf-1 siRNA組；b：抑制劑組；c：空白組；d：Hsulf-1 過表達組）

2.2 各組 Hsulf-1、p-AKT、E-cadherin和 β-catenin 蛋白表達水平比較 與空白組比較，Hsulf-1過表達組Hsulf-1、E-cadherin和β-catenin蛋白表達水平均明顯為高，p-AKT均明顯為低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；Hsulf-1 siRNA組p-AKT蛋白表達水平明顯為高，Hsulf-1、E-cadherin和β-catenin蛋白表達水平均明顯為低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；抑制劑組p-AKT、E-cadherin和β-catenin蛋白表達水平均明顯為低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與Hsulf-1 siRNA組比較，抑制劑組p-AKT、E-cadherin和β-catenin蛋白表達水平均明顯為低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見圖 2、3。

圖2 Hsulf-1、p-AKT、E-cadherin和β-catenin蛋白相對表達水平比較（Hsulf-1為人硫酸酯酶-1；p-AKT為磷酸化AKT；E-cadherin為上皮鈣黏蛋白；β-catenin為β-連環蛋白；與空白組比較，*P＜0.05；與 Hsulf-1 siRNA 組比較，△P＜0.05）

圖3 各組 Hsulf-1、p-AKT、E-cadherin和 β-catenin蛋白表達的電泳圖（Hsulf-1為人硫酸酯酶-1；p-AKT為磷酸化AKT；E-cadherin為上皮鈣黏蛋白；β-catenin為 β-連環蛋白；a：Hsulf-1siRNA 組；b：抑制劑組；c：空白組；d：Hsulf-1 過表達組）

2.3 各組SMMC7221細胞遷移能力比較 與空白組比較，Hsulf-1過表達組、Hsulf-1 siRNA組SMMC7221細胞遷移數均明顯為高，抑制劑組SMMC7221細胞遷移數明顯為低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與Hsulf-1 siRNA組比較，抑制劑組SMMC7221細胞遷移數明顯為低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組SMMC7221細胞遷移情況（個）

3 討論

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，近一半以上肝癌的新發病例發生在我國，具有生長快、轉移率及復發率高等特點。因此，研究肝癌發生、發展的相關機制對我國的衛生健康尤為關鍵。據報道，硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPGs）是細胞膜及細胞外基質的重要組成成分，可以通過硫酸化水平調控多種細胞因子信號通路，從而控制細胞的形成、黏附、增殖和分化等多種功能[10-13]，而Hsulf-1基因被認為是HSPGs硫酸化水平的調控因子，其表達異常可通過減少HSPGs的硫化作用，調控相應的細胞因子信號通路，與多種腫瘤的增殖、侵襲轉移密切相關，如卵巢癌、胃癌、乳腺癌、肝癌等。Roy等[14]在對卵巢癌的研究中發現，Hsulf-1集中表達在細胞表面，通過瞬時轉染Hsulf-1可顯著增加HSPGs中的硫酸葡萄糖胺水平，同時人肝素結合性表皮生長因子及成纖維細胞生長因子-2（FGF-2）誘導細胞因子的磷酸化水平顯著下降，并抑制腫瘤細胞增殖等，調控卵巢癌的發生、發展。在另外一項對頭頸部鱗狀癌細胞系SCCHN的研究中，結果發現Hsulf-1基因能顯著降低FGF-2及肝細胞生長因子（HGF）介導的細胞外信號調節激酶/絲裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）信號通路的活性，抑制腫瘤細胞的增殖及侵襲力，促進腫瘤細胞凋亡，與腫瘤的發生、發展密切相關[15-17]。有大量研究顯示，PI3K/AKT信號通路是調控腫瘤發生發展的關鍵通路，而AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它能被PI3K依賴的細胞外信號通路（如與表皮生長因子受體結合）激活，使其蛋白結構活化，處于磷酸化狀態[18-20]。被激活的AKT進入細胞，造成細胞內大量底物蛋白磷酸化，最終調節細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等表型，有研究證實在肝癌中，AKT信號通路與β-catenin相關[21-22]。

而在本研究中，筆者證實在肝癌細胞SMMC7221中，Hsulf-1過表達可抑制PI3K/AKT信號通路，并通過PI3K/AKT信號通路提高轉移相關蛋白E-cadherin以及β-catenin的表達。當筆者分別將Hsulf-1表達質粒，Hsulf-1 siRNA質粒轉染至肝癌細胞SMMC7221后，AKT磷酸化表達隨著Hsulf-1表達增加而減少，而E-cadherin以及β-catenin的表達則明顯增加，加入AKT抑制劑后，可發現E-cadherin以及β-catenin的表達明顯降低，表明AKT信號通路在Hsulf-1抑制肝癌細胞侵襲轉移中起到非常重要的作用。接著，筆者采用Transwell小室實驗法檢測肝癌SMMC7221細胞在不同處理下的遷移能力，結果顯示在Hsulf-1過表達后，肝癌SMMC7221細胞的侵襲能力明顯減少，而在加入AKT抑制劑后，Hsulf-1抑制肝癌SMMC7221細胞的侵襲能力則受到一定影響。

綜上所述，筆者證實Hsulf-1基因可抑制肝癌的侵襲轉移，且進一步闡明了PI3K/AKT信號通路參與肝癌侵襲轉移的作用機制，為肝癌轉移預防及治療提供新的方向。