禽腺病毒12個血清型代表毒株的分子生物學鑒定研究

侯力丹，宋佳誠，劉 丹，毛婭卿，楊亞希，黃小潔，吳應凱，王 嘉*，李俊平*

(1.中國獸醫藥品監察所，北京100081；2.中國農業大學動物醫學院，北京 100193；3. 國家獸用藥品工程技術研究中心，河南洛陽 471000)

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，曾稱為I群FAdV，可根據其分子生物學特征及限制性內切酶片段圖譜等方法分為A～E共5個種，12個血清型[1]，其多個種和血清型的特征為FAdV的鑒定、檢驗及診斷方法建立和相關疫苗評價等帶來很大挑戰。FAdV可引起雞包涵體肝炎(IBH)、心包積液綜合征(HPS)和肌胃糜爛 (GE) 等病癥，嚴重影響養禽業[2-4]。自2015年6月以來，我國山東、河南、河北等省份的部分地區雞群中發生了由血清4型FAdV引起的以心包積液和肝臟腫大為特征的傳染病，被稱為雞心包積液-肝炎綜合征(HHS)[5-7]。近期也報道了血清4型的I群FAdV在水禽中的感染病例[8]。除血清4型外，FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-10及FAdV-11等血清型在我國雞群中均有流行和感染，對我國養禽業造成嚴重影響[9-10]。目前，我國尚無商品化FAdV疫苗及診斷制品。因此，建立12個血清型FAdV代表毒株庫對于FAdV疫苗及診斷制品研發、評價等具有重要意義。

我國于20世紀70年代從國外引進了12個血清型毒株[11]，但一直未進行系統鑒定。本研究針對FAdV不同種的Hexon和Fiber序列設計引物，擬經PCR擴增和遺傳進化分析，對12個毒株進行基因分種鑒定。再結合同一種中不同血清型病毒Hexon序列上酶切位點的特征，通過限制性內切酶進行酶切，得到不同的酶切片段，確定同一種內不同血清型的病毒毒株種是否純凈，進一步完善12個血清型代表毒株毒種庫。

1 材料和方法

1.1 毒株和試劑 FAdV的12個血清型毒株由中國獸醫藥品監察所國家獸醫微生物菌種保藏管理中心保存。Axy Prep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自康寧生命科學有限公司。快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒Ⅱ型購自北京百泰克生物技術有限公司。TOP10感受態細胞、質粒小提試劑盒(離心柱型)購自天根生化科技(北京)有限公司。LB瓊脂、LB肉湯購自北京中海生物科技有限公司；pESAY-Blunt Simple Cliong Vector購自北京全式金生物技術有限公司。Acc65 Ⅰ、Hpa-Ⅰ、BsaBⅠ、AlwNⅠ、SacⅡ限制性內切酶購自NEB(北京)有限公司。KOD FX Neo 購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。2×Taq PCR Master Mix購自北京博邁德生物技術有限公司。

1.2 引物設計與合成 根據GenBank上FAdV不同型的參考毒株(表1)序列設計引物，用于擴增不同種FAdV的Hexon基因和Fiber基因全長片段，引物信息分別見表2和表3。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 FAdV的12種血清型參考毒株信息

表2 針對FAdV不同種Hexon全長基因擴增所需引物序列

表3 針對FAdV不同種Fiber全長基因擴增所需引物序列

1.3 FAdVHexon基因和Fiber基因的PCR擴增 使用DNA提取試劑盒分別提取12個血清型病毒DNA。以提取的DNA為模板，每對Fiber引物擴增所有毒株，Hexon引物擴增對應種的毒種。PCR反應體系為上下游引物各3 μL，KOD FX Neo 1 μL，KOD FX Neo buffer 25 μL，dNTP 10 μL，ddH2O 9 μL。

PCR反應條件為 94 ℃預變性2 min，98 ℃ 15 s，退火30 s，68 ℃ 按2000 bp/min延伸，共35個循環，68 ℃延伸10 min，4 ℃保存，同時設置陰性對照。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后使用膠回收試劑盒對目的片段進行回收。

1.4 FAdVHexon基因和Fiber基因序列測定及遺傳進化分析 將上一步得到的FAdVHexon基因和Fiber基因全長片段的PCR產物送北京六合華大基因科技有限公司測序，并用DNA STAR軟件對序列進行遺傳進化分析。將待檢毒株序列與參考毒株序列進行同源性比較和分析。

1.5Hexon基因的酶切鑒定 由于表3中的Fiber基因引物具有種特異性，所以前期通過對Fiber基因的PCR擴增，可實現對毒株種的分型和確定種的純凈性，并實現對血清1型(A種)和血清5型(B種)毒株的特異性和純凈性鑒定。通過PCR方法與酶切方法對Hexon基因全長進行鑒定，從而鑒定某一毒株內是否存在同種不同血清型污染。將1.3中各毒株Hexon基因的PCR產物進行膠回收，再使用不同的限制性內切酶將C、D、E種內不同血清型進行分型(表4)。選取Acc65Ⅰ分型C4與C10，選取HpaⅠ與BsaBⅠ分型D2、D3、D9、D11，選取AlwNⅠ和SacⅡ分型E6、E7、E8a、E8b。酶切體系為：膠回收產物20 μL，限制性內切酶1 μL，10×NEB Buffer 5 μL，H2O 24 μL。

2 結果與分析

2.1 目的基因Hexon的PCR擴增 利用本試驗設計的Hexon基因和Fiber基因種特異性引物(表2、表3)對12個血清型FAdV毒株的Hexon和Fiber基因ORF全長進行PCR擴增，分別得到與預期目的片段大小一致的基因片段，陰性對照無特異性擴增，結果見圖1和圖2。而用Fiber其他種的引物擴增各毒株，結果均為陰性，證明各毒株無其他種病毒污染，且表3中的Fiber引物具有種特異性。

M: DL5000 DNA Marker; 1: A1-Hexon; 2: B5-Hexon; 3: C4-Hexon; 4: C10-Hexon; 5: D2-Hexon; 6: D3-Hexon;7: D9-Hexon; 8: D11-Hexon; 9: E6-Hexon; 10: E7-Hexon; 11: E8a-Hexon; 12: E8b-Hexon; 13: Negative control

M: DL5000 DNA Marker; 1: A1- Fiber1; 2: A1- Fiber2; 3: D2- Fiber; 4: D3- Fiber;5: C4- Fiber1; 6: C4- Fiber2; 7: B5- Fiber; 8: E6- Fiber; 9: E7- Fiber; 10: E8a- Fiber;11: E8b- Fiber; 12: D9- Fiber; 13: C10- Fiber1; 14: 10- Fiber2; 15: D11- Fiber

2.2 不同種毒株Fiber的遺傳進化分析Fiber(Fiber2)基因ORF全長的核苷酸序列分析(圖3、圖4)顯示，A1、D2、D3、D11、E8a、E8b 六個毒株與相應參考毒株的同源性高達100%，E6、E7、D9三個毒株與相應參考毒株的同源性達99.9%，C4毒株與相應參考毒株的同源性為99.3%，B5毒株與相應參考毒株的同源性為95.8%，C10毒株與相應參考毒株的同源性為99.1%。同時，同種毒株間C4和C10同源性高，為96.9%，D3和D11同源性最低，為72.5%。而不同種毒株間表現為較低的同源性，其中A1與E7、E8a、E8b之間同源性最低，為4.9%。根據Fiber引物的特異性擴增結果，可對A1和B5型的毒株進行分型鑒定。

圖3 FAdV 不同血清型毒株Fiber基因遺傳進化分析

圖4 FAdV 不同血清型毒株Fiber基因同源性比較

2.3 不同種毒株Hexon基因的遺傳進化分析 將Hexon基因ORF全長的PCR產物進行測序，并用DNA STAR軟件進行分析(圖5、圖6)。結果顯示，C10、D2、D3、D11、E8a、E8b 六個毒株與FAdV參考毒株的同源性高達100%，其余毒株與參考毒株之間的同源性在99.1%到99.9%之間。B5與參考毒株340株的同源性相對較低，為77.3%。同時，同一種各毒株間D2和D11同源性最高，為99.1%，D2與D3或D11同源性最低，為80.4%。而不同種毒株間表現為較低的同源性，其中B5與C4同源性最低，為71.4%，與其余血清型毒株的同源性最高為76.6%。

圖5 FAdV 不同血清型毒株Hexon基因遺傳進化分析

圖6 FAdV 不同血清型毒株Hexon基因同源性比較

2.4 不同血清型毒株Hexon基因的酶切鑒定分析

2.4.1 FAdV-C種Hexon基因酶切結果 FAdV-C4-Hexon與FAdV-C10-Hexon的PCR回收使用Acc65Ⅰ酶切后，FAdV-C4-Hexon被切成三段，長度分別為1505 bp、935 bp、700 bp，而FAdV-C10-Hexon被切成兩段，長度分別為2439 bp和700 bp，與預期片段大小相符，酶切圖譜見圖7。

M: DNA Marker 2000; 1: FAdV-C4-Hexon Acc65Ⅰ酶切片段; 2: FAdV-C10-Hexon Acc65Ⅰ酶切片段

2.4.2 FAdV-D種Hexon基因酶切結果 FAdV-D2-Hexon、FAdV-D3-Hexon、FAdV-D9-Hexon、FAdV-D11-Hexon使用HpaⅠ酶切后，FAdV-D3-Hexon未被切開，FAdV-D9-Hexon 切為1159 bp和2136 bp兩條帶，FAdV-D2-Hexon、FAdV-D11-Hexon被切成2331 bp、500 bp和400 bp三條帶。再將FAdV-D2-Hexon和FAdV-D11-Hexon使用BsaB Ⅰ酶切，FAdV-D2-Hexon未被切開而FAdV-D11-Hexon被切成2717 bp和571 bp，與預期片段大小相符。酶切圖譜見圖8。

M: DNA Marker 5000; 1: FAdV-D2 HpaⅠ酶切片段; 2: FAdV-D3 HpaⅠ酶切片段; 3: FAdV-D9 HpaⅠ酶切片段; 4: FAdV-D11 HpaⅠ酶切片段; 5: FAdV-D2 BsaBⅠ酶切片段; 6: FAdV-D11 BsaBⅠ酶切片段

2.4.3 FAdV-E種Hexon基因酶切結果 FAdV-E6-Hexon、FAdV-E7-Hexon、FAdV-E8a-Hexon、FAdV-E8b-Hexon使用AlwN Ⅰ酶切后FAdV-E6-Hexon 未被切開，FAdV-E8b-Hexon 切為2162 bp和1024 bp兩條帶，FAdV-E7-Hexon、FAdV-E8a-Hexon被切成1232 bp、1021 bp和932 bp三條帶。再將FAdV-E7-Hexon和FAdV-E8a-Hexon使用SacⅡ酶切后， FAdV-E7-Hexon被切為273 bp和2918 bp兩條帶，而FAdV-E8a-Hexon則被切成2368 bp、547 bp和277 bp三條帶，與預期片段大小相符。酶切圖譜見圖9。

M: DNA Marker 5000; 1: FAdV-E6 AlwNⅠ酶切片段; 2: FAdV-E7 AlwNⅠ酶切片段;3: FAdV-E8a AlwNⅠ酶切片段; 4: FAdV-E8b AlwNⅠ酶切片段;5: FAdV-E7 SacⅡ酶切片段; 6: FAdV-E8a SacⅡ酶切片段

3 討論與結論

病毒分離鑒定、PCR及測序分析、瓊脂擴散試驗、病毒中和試驗等病原學和血清學方法是FAdV鑒定及感染診斷的常用方法[1,12]。相關方法的建立和驗證等需要背景清楚且純凈的FAdV相關標準毒株、核酸及特異性血清，其中標準毒株是基礎。Hexon蛋白作為禽腺病毒的主要結構蛋白之一，具有種及血清型特異性抗原決定簇，也與致病性密切相關。同時，在病毒感染中Fiber最先與細胞表面的受體結合，且具有較好的免疫原性，所以常被用于亞單位疫苗和檢測試劑盒的研究[13]。FAdV的種與血清型的對應關系中，A種對應血清1型，B種對應血清5型，C種對應血清4、10型，D種對應血清2、3、9、11型，E種對應血清6、7、8a、8b型。有關種與血清型對應關系的分子生物學分析方法，有關學者已進行了多種嘗試，獲得了非常有意義的參考依據[14]。相比Hexon基因，Fiber基因在不同基因型毒株之間保守性更低，而在不同基因型內不同血清型間保守性相對較高，因此，用于分型鑒定研究更具參考價值。本研究首次設計了針對5個種的Fiber基因鑒定引物，通過對12個血清型毒株Fiber基因全長序列進行PCR擴增，來區分不同種的FAdV，證明了毒株種的特異性，且各毒株不存在種間交叉。進一步對12個毒株Hexon基因和Fiber基因測序結果的遺傳進化分析，結果表明菌種庫引進的毒株中B5與B種參考毒株340株之間同源性為95.8%，其余11個毒株與對應參考毒株Fiber同源性在99.1%至100%之間。由于GeneBank中未見B種TR22毒株相應的基因參考序列，目前菌種庫中標注的TR22毒株Fiber序列與340毒株序列同源性為95.8%，與其它種的同源性僅為25.8%至56.6%，初步判定其為B種FAdV。而Hexon基因的分析結果表明，B5與參考毒株340株的同源性為77.3%，其余11個毒株與對應參考毒株Hexon基因同源性在99.1%至100%之間，進一步證明我所保存的毒株標注名稱與參考毒株名稱一致。

為確定毒株中是否污染同一種的其他血清型毒株，用酶切法對C、D、E種毒株的純凈性進行鑒定。根據不同血清型Hexon基因序列中酶切位點所在位置的差異，選取Acc65 Ⅰ、HpaⅠ、BsaB Ⅰ、AlwN Ⅰ、SacⅡ五種限制性內切酶，可以將C、D、E種的10個血清型毒株切為不同大小的片段樣態，以此來實現對不同毒株的的區分和鑒定。通過酶切產物片段的大小可知，各毒株均未污染本種中其他血清型的毒株，純凈性良好。與之前研究中只用Hexon基因進行分型的方法相比[1]，遺傳進化分析結合酶切法對FAdV 12個血清型毒株的Hexon基因和Fiber基因進行系統特異性和純凈性分析更為準確。

本研究表明，我國獸醫微生物菌種保存中心保存的FAdV 12個血清型毒株純凈性好，且與國際參考毒株一致，遺傳背景清晰可靠，為相應特異性血清制備、疫苗研發和相關檢驗診斷方法的建立提供了重要菌種資源。