牛、羊奶中莫昔克丁殘留高效液相色譜熒光檢測方法的建立

沈 昕，張玉潔，李 丹，孫紅洋，朱馨樂，黃耀凌

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

莫昔克丁，又稱莫西菌素，是一種由鏈霉菌發酵產生的結構單一的大環內酯類抗生素，為米爾貝霉素類藥物[1-2]，20世紀80年代中期開始在畜牧業中被作為驅蟲藥應用，具有高驅蟲活性、長效性及安全性的特點，莫昔克丁在較低劑量下即對線蟲和節肢動物有明顯殺滅作用[3-5]。由于莫昔克丁在結構上缺少一個二糖取代基，因此,脂溶性較好，同時也易溶于水。試驗證明，用藥后莫昔克丁在脂肪組織中分布較高，在肌肉與腎臟中分布較低，主要以藥物原形為其殘留方式[5-6]。有資料表明，莫昔克丁在組織內停留時間較長，而乳汁也是其主要排泄途徑之一，人類若長期食用含有莫昔克丁殘留的奶制品，會對其健康造成很大的威脅，因此，制定合理的休藥期及高效、靈敏的檢測方法十分必要。我國2019年發布的《GB 31650-2019 食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》中規定，牛、羊奶中莫昔克丁的最高殘留限量(MRL)為40 μg/kg[7]，但目前國內外關于莫昔克丁的檢測方法報道較少[8-11]，我國也沒有相應殘留檢測方法的國家標準。高效液相色譜法具有快速、靈敏的優點，且現在國內已基本普及，因此，建立一個高效、靈敏的液相色譜法對于更好的監測莫昔克丁在畜牧業中的合理化應用有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器設備 Agilent高效液相色譜儀(配熒光檢測器)，美國安捷倫公司；XS105DU分析天平，Mettler Toledo公司；AE260電子天平，Mettler Toledo公司；MS3渦旋混合器，ks 501 digital 振蕩器，IKA 公司；FV64氮吹儀，得泰儀器公司；Biofuge Strators 高速冷凍離心機，賀利氏公司；LC-213鼓風干燥箱,上海愛斯佩克環境儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑 莫昔克丁，含量≥94%，Dr.Ehrenstorfer；三乙胺；三氟乙酸酐；N-甲基咪唑；冰醋酸；乙腈、甲醇均為色譜純。

1.3 溶液的配制

1.3.1 標準溶液的配制 莫昔克丁標準儲備液(1 mg/mL)：精密稱取適量莫昔克丁標準品于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，成為濃度1 mg/mL的標準儲備液；量取適量標準儲備液，用乙腈稀釋為10 μg/mL 的標準工作液。

1.3.2 衍生化試劑的配制 A液：N-甲基咪唑-乙腈(1+1，V/V)，現用現配；B液：三氟乙酸酐-乙腈(1+2，V/V)，現用現配。

1.4 液相色譜條件 色譜柱：Phenomenonx luna C18， 250 mm × 4.6 mm(i.d), 粒徑5 μm；流動相：乙腈+水(90+10，V/V)；流速：1.8 mL/min；檢測波長：激發波長為365 nm，發射波長475 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。

1.5 標準曲線及線性范圍的測定 精密量取莫昔克丁標準工作液適量于容量瓶中，用乙腈稀釋成濃度為4、10、20、100、200和500 ng/mL的系列標準工作液。取以上6個濃度的標準工作液各1.0 mL于各自的10 mL試管中，于50 ℃水浴氮氣吹干，按衍生化步驟處理后，供高效液相色譜儀測定。從低濃度到高濃度依次測定，每一濃度進樣3針。以測得峰面積為縱坐標，對應的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。求回歸方程和相關系數。

1.6 樣品前處理 提取：稱取牛(羊)奶(2±0.02) g于50 mL離心管中，加乙腈3 mL，渦旋混勻，中速振蕩5 min，10000 r/ min離心5 min，收集上清液于另一50 mL離心管中。殘渣再重復提取一次。合并兩次上清液，加水3 mL，混勻，備用。

凈化與濃縮：C18固相萃取柱依次用乙腈 5 mL和30%乙腈水溶液 5 mL活化，將備用液過柱，用30%乙腈水溶液 5 mL淋洗，抽干。用乙腈5 mL洗脫，收集洗脫液于10 mL試管中，50 ℃水浴氮氣吹干。備用。

衍生化：向試管中依次加入衍生化試劑A液100 μL和衍生化試劑B液150 μL，密閉，渦動10 s，依次加冰醋酸、三乙胺各50 μL，渦動10 s，65 ℃避光密閉反應15 min，取出后加650 μL甲醇混勻。經0.45 μm微孔濾膜過濾，供高效液相色譜儀檢測。

1.7 方法靈敏度的確定 分別對北京超市購置的不同品牌的牛、羊奶進行篩選，所得空白樣品進行添加回收試驗，按照上述樣品前處理方法處理，進行HPLC 分析，測得藥物色譜保留處的基線噪音值，求其平均值。以S/N≥3作為該方法藥物的檢測限；以S/N≥10，且在該添加水平的回收率和變異系數均滿足殘留分析要求的最小濃度作為定量限(LOQ)。

1.8準確度和精密度的測定 采用標準添加法，在空白牛奶、羊奶中分別添加定量限、1/2 MRL、MRL和2 MRL四個濃度(5、20、40、80 μg/kg)的莫昔克丁標準工作液進行回收率試驗，各濃度進行5個樣品平行試驗，同時重復3次空白試驗，求每個樣品的回收率和批內、批間相對標準偏差(RSD)。

2 結果與分析

2.1 標準曲線及線性范圍 取4、10、20、100、200和500 ng/mL標準溶液濃度點進行檢測，莫昔克丁在該濃度范圍內呈良好線性關系，回歸方程為y=0.3303x- 0.6572,R2= 0.9998。

2.2方法靈敏度 按照本文建立方法，添加莫昔克丁濃度為2 μg/kg時，S/N≥3，添加莫昔克丁濃度為5 μg/kg時，S/N≥10，因此，本方法檢測限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg。標準對照液、空白牛奶及添加試樣中的高效液相色譜圖見圖1。

(A)莫昔克丁標準溶液色譜圖(10 ng/mL) (B)空白牛奶試樣色譜圖(C)空白牛奶添加莫昔克丁試樣色譜圖(5 μg/kg)

2.3 方法準確度和精密度 根據莫昔克丁在牛、羊奶中MRL規定，在空白試料中添加定量限、1/2 MRL、MRL和2 MRL四個濃度的莫昔克丁，進行回收率試驗，每個濃度設置5個平行樣品，并重復3次，按照上述方法處理后，高效液相色譜(熒光檢測器)檢測。分別計算回收率以及批內、批間變異系數，結果見表1、表2。

表1 空白牛奶中添加莫昔克丁的回收率測定結果(n= 5)

表2 空白羊奶中添加莫昔克丁的回收率測定結果(n= 5)

結果表明：本方法在5～ 80 μg/kg 添加濃度范圍內，牛、羊奶的回收率范圍分別為75.5%～110%、77.5%～95.6%；批內變異系數分別為0.84%～7.38%，1.25%～5.06%；批間變異系數分別為3.98%～7.87%，2.62% ～5.92%。

3 討論與結論

3.1 提取條件的優化 根據現有文獻作為參考[8-12]，并根據莫昔克丁易溶于多種有機溶劑的結構性質，本方法分別選用乙酸乙酯、20%乙醇乙腈、乙腈對莫昔克丁進行提取，經試驗發現，莫昔克丁用乙酸乙酯提取回收率較低，用20%乙醇乙腈、乙腈提取時，回收率均能達到80% 以上，但經進一步比較分析，用20%乙醇乙腈提取后，莫昔克丁藥物峰形變寬，因此，本方法選擇乙腈作為提取溶劑，并通過高速離心去除蛋白質等大量雜質的干擾，有效提取其中的莫昔克丁藥物。

3.2 衍生化條件的優化 莫昔克丁為米爾貝霉素類藥物，其分子結構與阿維菌素類藥物十分類似，適合用高效液相色譜法進行測定。此類藥物衍生化后的熒光響應值高，雜質干擾少，且相較于成本更高的液相色譜-質譜法成本低，具有更好的普適性。在目前衍生化方法中，對阿維菌素類藥物的衍生化試劑普遍使用N-甲基咪唑-乙腈(1+1，V/V)和三氟乙酸酐-乙腈(1+2，V/V)進行[13]。本實驗對衍生化的溫度、時間、光照條件等進行了摸索。經試驗比較發現，若在室溫下進行衍生化，則需要較長反應時間；若在加熱條件下進行，65 ℃反應15 min，即可充分衍生化。同時，在反應溫度和時間一定的前提下，在正常光照和避光兩種條件下，前者藥物的峰面積均明顯低于后者。因此，本方法選用65 ℃反應避光15 min衍生化條件。此反應條件衍生化反應效率高、反應充分、雜質干擾少，反應后的衍生產物與甲醇混合后，形成穩定的醇式衍生物，其含量穩定，保存一天以后進樣，測得莫昔克丁藥物峰面積與立即進樣峰面積基本無變化。

3.3 色譜條件的優化 本試驗經過衍生化后，基質中的干擾成分已基本去除，藥物色譜峰保留時間內也無干擾。因此，在色譜條件上，本試驗將流速增加至1.8 mL/min，同時將柱溫升高至40 ℃，縮短了分析時間，提高了試驗效率。本方法與李林霞等[8]建立的HPLC方法相比，減少了提取液用量，加快了提取液經固相萃取柱凈化速度，且優化了色譜條件，加大了流速，提高了柱溫，使藥物保留時間由15 min提前至12 min，更好的去除了樣品中雜質干擾，在縮短了試驗的前處理和樣品檢測時間、加快了試驗進度的同時，保證了樣品的基質效應降得更低，為檢測莫昔克丁大批量試驗保證了效率和準確度。

本試驗建立了牛、羊奶中莫昔克丁殘留的高效液相色譜檢測方法，其檢測限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg，平均回收率范圍為75.5%～ 110%，批間及批內變異系數均低于7.87%。該方法操作簡單、適用性強、靈敏度高，可滿足檢測工作的需要。