中藥制劑歸芎益母散的質量標準研究

吳雪琴, 孫 研,王勝義,王 磊,吳亮紅,岳 鵬,崔東安

(中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所甘肅省中獸藥工程技術研究中心,中國農業科學院蘭州獸醫研究所，甘肅 蘭州 730050)

歸芎益母散是以中獸醫學理、法、方、藥為基礎，遵循君臣佐使原則，結合中藥研究，研制出的復方散劑，是由益母草、當歸、川芎、紅花、香附和甘草[3]等中藥制成的散劑，益母草對子宮有雙向調節作用,可以降低產后子宮的TNF-α、基質金屬蛋白酶抑制物 (TIMP-1) 水平, 啟動止血修復機制, 并加快細胞外基質 (ECM) 降解, 從而加速產后子宮修復[1-2]。當歸、川芎和紅花是中獸醫經典活血化瘀藥材,對子宮均有調節作用,可加速子宮內殘留蛻膜及分泌物排出,促進產后子宮修復[4-6]。甘草具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等多種作用[7]。其臨床試驗驗證，功效主要有“活血化淤、行氣止痛”，主要用于奶牛產后惡露不行，胎衣不下，血瘀腹痛等癥[6]。

為探索歸芎益母散的質量控制指標及方法，采用薄層色譜法對歸芎益母散中的中藥成分進行定性鑒別，采用高效液相色譜法對 “歸芎益母散”中的鹽酸水蘇堿進行定量測定等多方面研究歸芎益母散的質量標準。從而保證該中獸藥復方制劑的產品質量，使其在臨床安全有效使用，以此達到減少奶牛因胎衣不下而引發的各種相關疾病，提高奶制品質量，促進我國奶牛養殖業的發展的目標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 蒸發光檢測器高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；點樣儀(SP-20E,上海科哲有限公司)；薄層色譜成像儀(Goodlook-1000,上海科哲有限公司)；微量分析天平(RADWAG Wagi Elektroniczne)；電子天平(AL104,梅特勒有限公司)；超聲波清洗器(昆山潔力美超聲儀器有限公司)；硅膠G板(200 mm×100 mm,國藥集團化學試劑有限公司)；電熱套(上海瑞茲儀器設備有限公司)。

1.1.2 藥品 歸芎益母散(中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所研制)。鹽酸水蘇堿(批號：110712-201614，中國食品藥品檢定研究院)、益母草(120912-201209，中國食品藥品檢定研究院)當歸(120927-201315，中國食品藥品檢定研究院)、川芎(120918-201411，中國食品藥品檢定研究院)、紅花(120907-201412，中國食品藥品檢定研究院)。

甲醇、乙腈為色譜純；丙酮、正己烷、乙醇、鹽酸、硫氰酸鉻銨、丙酮、硫酸銀、氯化鋇、冰醋酸等為分析純。

1.2 方法

1.2.1 定性鑒別

1.2.1.1 益母草的TCL 樣品溶液的制備：取歸芎益母散3.5 g置錐形瓶中，再加入50 mL無水乙醇，搖勻，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加0.1 moL/mL鹽酸溶液10 mL使溶解，濾過，濾液加入新配制的雷氏銨鹽飽和溶液15 mL，4 ℃放冷1 h，濾過，沉淀加約20 mL水洗滌，濾過，加丙酮2 mL使溶解，作為供試品溶液。取其他批次的樣品做重復。

陰性對照溶液的制備：根據處方比例，去除益母草后，將各個藥按比例稱取，按照歸芎益母散樣品溶液處理方法，制成陰性對照溶液。

對照藥材溶液的制備：稱取對照藥材益母草1.0005 g置錐形瓶中，加10 mL無水乙醇，搖勻，同法制成對照藥材溶液。

對照品的制備：精密稱取對照品鹽酸水蘇堿10.0006 mg置5 mL容量瓶中，加甲醇定容，即為2.0003 mg/mL的對照品溶液。

測定方法：參照薄層色譜法(附錄43頁)試驗[8]，分別取10 μL陰性對照溶液、三批不同批次的樣品溶液，5 μL對照藥材溶液、對照品溶液，依次點于硅膠G板上，將丙酮：無水乙醇：鹽酸(10∶6∶1)混合液作為展開劑，展開，取出。于105 ℃加熱15 min，放冷后噴以稀碘化鉍鉀試液：三氯化鐵試液(10∶1)，晾干，日光下檢視。

1.2.1.2 當歸、川芎的薄層鑒別 樣品溶液的制備：取歸芎益母散5 g置錐形瓶中，加正己烷50 mL，超聲處理30 min，過濾后，將濾液蒸干后，加1 ml正己烷溶解殘渣，即為樣品溶液。取其他批次的樣品做重復[8]。

陰性對照溶液的制備：根據處方比例，去除當歸和川芎后，將各個藥按比例稱取，按照歸芎益母散樣品溶液處理方法，制成陰性對照溶液。

對照藥材溶液的制備：取當歸對照藥材1 g，川芎對照藥材1 g，當歸、川芎混合對照藥材1 g(當歸對照藥材、川芎對照藥材各0.5 g)，按照歸芎益母散樣品溶液處理方法，制成對照藥材當歸、川芎以及當歸和川芎混合溶液。

方法測定：參照薄層色譜法(附錄43頁)試驗[8]，分別取3 μL陰性對照溶液、三批不同批次的樣品溶液，2 μl當歸和川芎混合對照藥材溶液、當歸對照藥材溶液、川芎對照藥材溶液，依次點于硅膠G板上，將石油醚(60～90 ℃)：乙酸乙酯(10∶0.4)作為展開劑，展開，取出后晾干，并置紫外燈(365 nm)檢視。

1.2.1.3 紅花的薄層鑒別 樣品溶液的制備：取歸芎益母散10.0000 g置錐形瓶中, 再加80%丙酮50 mL,搖勻后超聲處理15 min，過濾，蒸干濾液，加5 mL 80%丙酮溶解殘渣，作為樣品溶液[9-10]。取其他批次的樣品做重復。

陰性對照溶液的制備：根據處方比例，去除紅花后，將各個藥按比例稱取，按照歸芎益母散樣品溶液處理方法，制成陰性對照溶液。

對照藥材溶液的制備：稱取對照藥材紅花0.5003 g置錐形瓶中，加入5 mL 80%丙酮，搖勻后超聲處理15 min，靜置，取上清，作為對照藥材溶液。

方法測定：參照薄層色譜法(附錄43頁)試驗[8]，分別取10 uL陰性對照溶液、三批不同批次的樣品溶液, 5 μL對照藥材溶液，依次點于硅膠G薄層板上，將乙酸:乙酯丁酮:甲酸:水(5∶3∶1∶1)混合液作為展開劑，展開后，取出，晾干，日光下檢視。

1.2.2 歸芎益母散中鹽酸水蘇堿含量測定

1.2.2.1 溶液的制備 樣品溶液的制備：精密稱取歸芎益母散2.0002 g置圓底燒瓶中，加50 mL 70%乙醇后稱重，回流2 h，放冷，70%乙醇加足重量，離心，精密吸取上清液25 mL, 蒸干，用0.1 moL/mL稀鹽酸25 mL溶解，離心(3000轉/分) 10 min，傾出上清液，加少量0.1 moL/mL稀鹽酸洗滌沉淀，洗液合并入上清液，并加入新配制的2.5%硫氰酸鉻銨溶液20 mL，振搖，置冰浴(4 ℃)中3 h，離心(3000轉/分) 10 min，棄去上清液，沉淀用少量冰水洗滌后，棄去洗液，加2 mL丙酮使溶解。丙酮液中滴加0.5%硫酸銀溶液6 mL，離心(3000轉/分) 10 min，傾出上清液，沉淀用少量丙酮洗滌，合并洗液與上清液并滴加1%氯化鋇溶液2 mL，離心(3000 轉/分)10 min，傾出上清液，沉淀用70%乙醇洗滌，洗液加入上清液，蒸干，加適量70%乙醇使其殘渣溶解，并轉移至5 mL量瓶中，定容，即得歸芎益母散樣品溶液。

對照品溶液的制備：精密稱取3.375 mg對照品鹽酸水蘇堿置10 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容，即得0.0375 mg/mL的鹽酸水蘇堿對照品溶液。

陰性對照液的制備：根據處方比例，去除益母草后，將各個藥按比例稱取，按照歸芎益母散樣品溶液處理方法，制成陰性對照溶液。

1.2.2.2 色譜條件 色譜柱：Venusil HILIC(250 mm×4.6 mm，5 um，天津博納艾杰爾科技有限公司)；乙腈:0.2%乙酸水溶液(83:17)；體積流量0.8 mL/min；蒸發光散射器；柱溫25 ℃；檢測器溫度50 ℃，霧化室溫度80 ℃；進樣量10 uL。理論塔板數按鹽酸水蘇堿峰計算均不低于5000。

1.2.2.3 專屬性試驗 分別吸取1.2.2.1中對照品鹽酸水蘇堿溶液、歸芎益母散樣品溶液、去除益母草的其他藥陰性對照液各10 μL進樣，記錄色譜峰。

1.2.2.4 線性范圍考察 分別精密稱定鹽酸水蘇堿對照品8.115 mg置10 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成含鹽酸水蘇堿為0.8115 mg/mL的對照品儲備溶液。分別精密吸取對照品儲備液適量，加甲醇稀釋成含鹽酸水蘇堿0.115、0.40575、0.202875、0.1014375、0.05071875 mg/mL的系列溶液，精密吸取10 μL，按照上述色譜條件注入色譜儀，以測定峰面積對數對鹽酸水蘇堿濃度進行回歸分析。

1.2.2.5 精密度試驗 取鹽酸水蘇堿對照品濃度為0.285 mg/mL溶液，按2.1.2.2色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，并計算RSD。

1.2.2.6 日間穩定性考察 取2.1.2.1中樣品溶液，按2.1.2.2色譜條件分別在0、4、8、12、24 h吸取該樣品溶液10 μL，進樣、測定并記錄峰面積，并計算RSD。

1.2.2.7 重復性試驗 精密稱定取同一批樣品6份2.0 g，按“樣品溶液制備”項下操作，按2.1.2.2色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算RSD。

1.2.2.8 準確性試驗 取已知含有量的樣品6份，精密稱定2 g，按樣品已知含量的100%加入鹽酸水蘇堿標準品1.116 mg/mL各加3.3 mL。按2.1.2.1 “樣品溶液制備”項下，按2.1.2.2色譜條件進樣測定，記錄峰面積后計算加樣回收率，并計算RSD。

2 結果與分析

2.1 定性鑒別結果

2.1.1 益母草的薄層鑒別 益母草的定性鑒別結果見圖1，圖中，歸芎益母散樣品在與鹽酸水蘇堿對照品相應的位置上，顯示相同顏色的斑點，陰性對照樣品無相應斑點，但陰性對照樣品與益母草對照藥材有相同顏色的斑點。參考女金丸、產康復顆粒、四物益母丸等制劑的質量標準中益母草的鑒別[9]，僅保留鹽酸水蘇堿對照品作為鑒別對照，方法具有專一性。

圖1 歸芎益母散中益母草的的TCL圖

2.1.2 當歸、川芎的薄層鑒別 當歸、川芎的薄層鑒別結果見圖2。圖中，歸芎益母散樣品在與對照藥材相應的位置上，顯示相同的顏色的熒光斑點。

圖2 歸芎益母散中當歸、川芎的TCL

2.1.3 紅花的薄層鑒別 紅花的薄層鑒別結果見圖3。圖中，歸芎益母散樣品在與對照藥材相應的位置上，顯示相同的顏色的主斑點。陰性樣品無相應的斑點，斑點清晰，方法具有專一性。

圖3 歸芎益母散中紅花的TCL圖

2.2 歸芎益母散中鹽酸水蘇堿含量測定結果

2.2.1 專屬性試驗結果 試驗結果中，樣品中鹽酸水蘇堿峰型對稱度好，陰性樣品在鹽酸水蘇堿處無吸收，無干擾歸芎益母散的測定。理論塔板數按鹽酸水蘇堿計為9698。試驗結果見圖4-圖6。

圖4 鹽酸水蘇堿對照品色譜圖

圖5 歸芎益母散供試品中中鹽酸水蘇堿色譜圖

圖6 陰性樣品中鹽酸水蘇堿色譜圖

2.2.2 線性范圍考察 以鹽酸水蘇堿對照品濃度對數為橫坐標(x)，色譜峰面積對數為縱坐標(y)，進行線性回歸，得出回歸方程y=1.54x+0.5123，R2=0.9996，見圖7，結果表明，鹽酸水蘇堿濃度在0.0507～0.8115 mg范圍與峰面積對數呈良好的線性關系。

圖7 標準曲線

2.2.3 精密度試驗 計算RSD，RSD(n=6)為0.83%，表明本方法精密度良好，可以滿足含量測定要求。試驗結果見表1。

表1 鹽酸水蘇堿精密度試驗結果表

2.2.4 日間穩定性試驗 計算含量和RSD，RSD(n=6)為0.66%，表明樣品在24 h內穩定，試驗結果見表2。

表2 鹽酸水蘇堿日間穩定性試驗結果表

2.2.5 重復性試驗 計算含量和RSD，RSD(n=6)分別為1.25%，表明樣品制備方法重復性良好。試驗結果見表3。

表3 鹽酸水蘇堿重復性試驗結果表

2.2.6 準確性試驗 計算回收率和RSD，樣品中鹽酸水蘇堿平均回收率(n=6)為107.15%，RSD為1.90%。試驗結果見表4。

表4 鹽酸水蘇堿加樣回收試驗結果表

回收率計算公式為：

式中：A為樣品所含被測成分量，B為加入對照品量，C為實測量。

2.2.7 樣品測定試驗 經測定，三批鹽酸水蘇堿的平均含量分別為2.320 、2.294、2.201 mg/mL，RSD=2.75%，說明不同批號的川芎益母散中鹽酸水蘇堿的含量穩定。

表5 樣品測定鹽酸水蘇堿試驗結果表

3 討 論

益母草作為歸芎益母散中的君藥，其鹽酸水蘇堿含是衡量歸芎益母散制劑質量的重要指標性成分，對鹽酸水蘇堿使用ELSD法進行定量研究，且結果表明此法測定歸芎益母散中的鹽酸水蘇堿專屬性強、穩定性好、精密度高，且陰性無干擾。對君藥益母草和輔藥川芎、當歸和紅花進行TCL研究，結果表明歸芎益母散樣品在與對照品相應的位置上，顯示相同的顏色的主斑點，陰性樣品無相應的斑點，TLC鑒別方法斑點清晰，專屬性強，重現性好。因此通過對歸芎益母散中益母草、川芎、當歸和紅花的定性鑒別及鹽酸水蘇堿的含量測定，能夠有效控制歸芎益母散質量。

在歸芎益母散中益母草的TCL研究中，色譜方法參照2015版《中國藥典》一部1006頁[11]，陰性對照樣品與益母草對照藥材色譜圖中有相同顏色的斑點，但與對照品鹽酸水蘇堿無對應的斑點，參考藥典中女金丸、產康復顆粒、四物益母丸等制劑的質量標準中益母草的鑒別[12]，僅保留鹽酸水蘇堿對照品作為鑒別對照。

在紅花TLC 鑒別方法中，將歸芎益母散樣品及對照藥材紅花提取液蒸干時，使用減壓濃縮法至干，不可水浴蒸干。

在測定歸芎益母散中鹽酸水蘇堿含量時，制備供試品過程中：加20 mL2.5%硫氰酸鉻銨溶液后，冰浴(4 ℃)時間越久，測定含量呈上升趨勢，3 h為最佳，因此冰浴時間為3 h。在加1%氯化鋇溶液前濃縮為1 mL與不濃縮均對測定鹽酸水蘇堿含量結果無明顯差異，因此在實驗中在加1%氯化鋇溶液前不濃縮。

4 結 論

研究建立的君藥益母草、輔藥川芎、當歸和紅花進行TLC鑒別陰性對照無干擾、斑點清晰且專屬性較強。益母草中鹽酸水蘇堿的含量測定方法簡便易行，重現性較好，為控制和評價歸芎益母散的質量提供科學依據。