阿莫西林可溶性粉中非法添加氟苯尼考的HPLC-PDA檢測方法的建立

王 軒，韓寧寧，楊秀玉，戴 青，汪 霞，趙 暉

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

阿莫西林是一種半合成的青霉素類抗生素，具有抗菌譜廣、耐酸性、制劑使用方便等特點(diǎn)，在獸醫(yī)臨床中普遍應(yīng)用。其中，阿莫西林可溶性粉是由阿莫西林與無水葡萄糖配制而成的，用于治療雞對阿莫西林敏感的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌感染[1]。氟苯尼考是一種動(dòng)物專用的酰胺醇類抗生素，是氯霉素的氟化衍生物，具有良好的抗菌能力。由于其抗菌譜廣、毒性低、吸收迅速、用藥后體內(nèi)分布廣泛等特點(diǎn)，多種氟苯尼考制劑被研發(fā)并應(yīng)用于獸醫(yī)臨床中[2-3]。由此可見，氟苯尼考和阿莫西林在功能藥效方面具有相似性。目前，對氟苯尼考的含量測定方法有高效液相色譜法[4]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5]和酶聯(lián)免疫法[6]等。在監(jiān)督檢驗(yàn)工作中，通過篩查發(fā)現(xiàn)市售某企業(yè)的一批阿莫西林可溶性粉中非法添加了氟苯尼考，因此，參考《中國獸藥典》2015年版一部氟苯尼考質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)檢測方法[7-9]，選擇氟苯尼考為測試藥物，阿莫西林可溶性粉為目標(biāo)制劑，采用高效液相色譜法與二極管陣列檢測器，建立阿莫西林可溶性粉中非法添加氟苯尼考的HPLC-PDA檢測方法，為打擊獸藥制劑非法添加氟苯尼考制假行為提供技術(shù)支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑 Waters 2695高效液相色譜儀配有二極管陣列檢測器(PDA2998)和色譜工作站處理軟件Empower 3(美國Waters公司)、AX205型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。乙腈為色譜純，水為超純水。

1.2 試藥 氟苯尼考對照品(含量99.1%，批號K0301703，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。

1.3 供試品

1.3.1 制劑空白 阿莫西林可溶性粉，某市售產(chǎn)品，為檢驗(yàn)合格、無非法添加的產(chǎn)品，批號20190108，規(guī)格10%。

3.1.2 疑似陽性樣品 阿莫西林可溶性粉，某市售產(chǎn)品，批號20200601，規(guī)格10%。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Dikma Diamonsil C18(4.6×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈-水(33∶67，V/V)，流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL，二極管陣列檢測器(PDA)，檢測波長190～400 nm，記錄224 nm波長處的色譜圖。

2.2 溶液制備

2.2.1 空白溶液 制劑空白溶液：稱取阿莫西林可溶性粉制劑空白樣品1 g，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度。溶劑空白溶液：流動(dòng)相溶液。

2.2.2 對照品溶液 取氟苯尼考對照品約25 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。置4 ℃冰箱保存。

2.2.3 供試品溶液 稱取阿莫西林可溶性粉制劑1 g，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 陽性添加樣品溶液 稱取阿莫西林可溶性粉制劑空白樣品1 g，置50 mL量瓶中。取氟苯尼考對照品約12.5 mg，精密稱定，加入同一量瓶中，用流動(dòng)相溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.5 檢測限溶液 稱取氟苯尼考對照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相使溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含0.1 mg的溶液，作為氟苯尼考對照品溶液。取阿莫西林可溶性粉制劑空白供試品1.0 g，置50 mL量瓶中，平行制備3份，分別精密加入氟苯尼考對照品溶液1、2、4 mL，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.6 光譜數(shù)據(jù)庫溶液 使用2.2.2項(xiàng)對照品溶液作為建立光譜數(shù)據(jù)庫的溶液，建立氟苯尼考光譜數(shù)據(jù)庫。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性 通過空白試驗(yàn)排除阿莫西林可溶性粉制劑中主要成分對被測物的干擾。精密量取阿莫西林可溶性粉制劑空白溶液和氟苯尼考對照品溶液各10 μL，照2.1項(xiàng)色譜條件，注入高效液相色譜儀中，同時(shí)記錄色譜圖和光譜指數(shù)圖(圖1～圖3)。結(jié)果表明，阿莫西林可溶性粉制劑本底在氟苯尼考峰保留時(shí)間附近無干擾。

圖1 阿莫西林可溶性粉制劑空白溶液的光譜色譜圖

圖2 氟苯尼考對照品色譜圖(50 μg/mL)

圖3 阿莫西林可溶性粉中添加氟苯尼考的光譜圖

2.3.2 線性 取氟苯尼考對照品約20 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為氟苯尼考對照品儲備溶液。精密量取氟苯尼考對照品儲備溶液5、5、5、5、5、1、1 mL置于10、20、50、100、200、100、200 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得，制備成濃度為100、50、20、10、5、2、1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，照2.1項(xiàng)色譜條件測定，每個(gè)濃度點(diǎn)平行測定兩次。按氟苯尼考峰峰面積與對應(yīng)的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。氟苯尼考回歸方程為y=21986x-2528.1，R2=1.000。表明氟苯尼考在濃度為1～200 μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 檢測限 本方法以光譜圖最大失真濃度的二倍作為本方法的檢測限，并保證檢測限濃度下樣品與對照品溶液的保留時(shí)間一致(差異小于等于±5%)，最大吸收波長一致(差異小于等于±2.4 nm)，色譜峰的純度角度小于純度閾值，PDA匹配角度小于PDA匹配閾值。將檢測限試驗(yàn)溶液中氟苯尼考峰與光譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，結(jié)果顯示，濃度低時(shí)光譜指數(shù)圖會發(fā)生輕微變形，且匹配角度與匹配閾值的數(shù)值均變大。當(dāng)添加量為最大失真濃度(0.2 g/kg)及以上的溶液時(shí)，氟苯尼考PDA匹配角度均小于PDA匹配閾值。雖然光譜指數(shù)圖發(fā)生輕微變形時(shí)仍能實(shí)現(xiàn)與光譜庫中對照品光譜的匹配，但考慮到獸藥非法添加量一般都較大，本檢驗(yàn)方法仍以光譜圖失真的最大濃度的二倍作為方法的檢出限，即氟苯尼考檢出限為0.4 g/kg。

2.3.4 陽性樣品測定 取阿莫西林可溶性粉陽性樣品，照2.2.3項(xiàng)配制供試品溶液，氟苯尼考對照品溶液的濃度調(diào)整為峰面積與供試品溶液相當(dāng)。分別精密量取10 μL，注入高效液相色譜儀，照2.1項(xiàng)色譜條件，同時(shí)記錄色譜圖和光譜圖。結(jié)果顯示，供試品溶液在與氟苯尼考對照品峰保留時(shí)間一致處出峰；該色譜峰純度角度小于純度閾值，為單一物質(zhì)峰；將其光譜與氟苯尼考對照品的光譜匹配，匹配角度小于匹配閾值，說明與氟苯尼考對照品的光譜相似，且兩者最大吸收波長一致。以上結(jié)果表明樣品中檢出氟苯尼考(表1)。

表1 氟苯尼考峰純度及光譜相似度檢查結(jié)果表

2.3.5 準(zhǔn)確度 通過陽性樣品制劑與空白樣品制劑中分別加入氟苯尼考對照品做回收率試驗(yàn)考察方法的準(zhǔn)確度。取阿莫西林可溶性粉陽性樣品，照2.2.3項(xiàng)配制供試品溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，照2.1項(xiàng)色譜條件測定。重復(fù)測定2次。陽性樣品回收率溶液：取阿莫西林可溶性制劑陽性樣品1 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，分別添加三份不同質(zhì)量(約10.6、13.0、15.6 mg)的氟苯尼考對照品，精密稱定，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。精密量取10 μL，注入液相色譜儀，照2.1項(xiàng)色譜條件測定。每個(gè)濃度重復(fù)3次。結(jié)果見表2。空白樣品回收率溶液：取阿莫西林可溶性粉空白樣品1 g，置50 mL量瓶中。取氟苯尼考對照品約12.50 mg，精密稱定，加入同一量瓶中，用流動(dòng)相溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。精密量取10 μL，注入液相色譜儀，照2.1項(xiàng)色譜條件測定。重復(fù)測定6次。結(jié)果見表3。阿莫西林可溶性粉制劑陽性樣品中，氟苯尼考在三個(gè)濃度水平的回收率分別為102.6%(RSD=0.4%)、100.0%(RSD=0.4%)和98.6%(RSD=0.6%)，阿莫西林可溶性粉制劑空白樣品中氟苯尼考的回收率為100.4%(RSD=0.5%)。

表2 陽性樣品回收率結(jié)果

表3 空白樣品回收率結(jié)果

2.3.6 耐用性 以回收率試驗(yàn)溶液作為耐用性試驗(yàn)溶液。從柱溫、流動(dòng)相組成、色譜柱三方面考察阿莫西林可溶性粉制劑中氟苯尼考檢測方法的耐用性。調(diào)節(jié)柱溫為25、30、35 ℃，結(jié)果表明，隨著柱溫升高，氟苯尼考峰的保留時(shí)間逐漸前移。在三種柱溫條件下，氟苯尼考峰純度角度均小于純度閾值，PDA匹配角度均小于PDA匹配閾值，與阿莫西林峰的分離度、理論塔板數(shù)均符合要求；調(diào)節(jié)流動(dòng)相組成為乙腈-水(28-72)、乙腈-水(33-67)和乙腈-水(38-62)，結(jié)果顯示，在不同流動(dòng)相組成下，氟苯尼考峰的純度、理論塔板數(shù)和分離度均符合要求；選擇3款不同品牌色譜柱(Dikma Diamonsil，4.6 mm×250 mm，5 μm；Alltima，4.6 mm×250 mm，5 μm；Agilent Zorbax，4.6 mm×250 mm，5 μm；)，考察不同色譜柱對測定的影響，三款色譜柱結(jié)果顯示，氟苯尼考純度角度均小于純度閾值，PDA匹配角度均小于PDA匹配閾值，且分離度均符合要求。

3 討論與結(jié)論

3.1 提取波長的確定 采用二極管陣列檢測器，對190～400 nm波長范圍進(jìn)行紫外吸收掃描。氟苯尼考在192 nm和223 nm處存在最大吸收，后者吸光度較低。但由于200 nm以下的光可被溶劑吸收，易造成誤差。同時(shí)，參考《中國獸藥典》2015年版一部中氟苯尼考含量測定方法，氟苯尼考的檢測波長均為224 nm。本實(shí)驗(yàn)中檢測波長為223 nm是由于PDA檢測分辨率為1.2 nm造成，故選擇224 nm作為提取波長。

3.2 流動(dòng)相的選擇 《中國獸藥典》2015年版收載了氟苯尼考及其相關(guān)制劑有關(guān)物質(zhì)及含量的測定條件，均為高效液相色譜法，以乙腈-水-冰醋酸(100∶197∶3)為流動(dòng)相，檢測波長224 nm。現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的氟苯尼考測定方法中，以高效液相色譜方法為主。綜合參考《中國獸藥典》和文獻(xiàn)報(bào)道的方法，當(dāng)流動(dòng)相中加入冰醋酸后，光譜指數(shù)圖在低波長處會出現(xiàn)不規(guī)則鋸齒，從而造成光譜圖失真[10]。本檢驗(yàn)方法以光譜圖失真的最大濃度的二倍作為方法的檢出限，加入冰醋酸后會導(dǎo)致檢測限升高。因此，本檢查方法選擇使用乙腈-水(33∶67)為流動(dòng)相，對阿莫西林可溶性粉制劑中的氟苯尼考進(jìn)行測定。

3.3 檢查方法的擴(kuò)展使用 除阿莫西林可溶性粉制劑外，當(dāng)采用該檢測方法用于其他獸藥制劑的檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行空白試驗(yàn)和檢測限測定。必要時(shí)，可調(diào)整供試品溶液或?qū)φ掌啡芤旱臐舛龋箖烧叻迕娣e相似。通過與對照品溶液色譜圖保留時(shí)間、光譜圖的對比，確定供試品中是否含有氟苯尼考。

3.4 保留時(shí)間、峰純度檢查與光譜相似度檢查 目標(biāo)組分保留時(shí)間是否一致是判斷兩個(gè)色譜峰是否為同一化合物的初步依據(jù)，峰純度檢查可以判斷該峰是否為單一物質(zhì)峰，光譜相似度檢查可以排除保留時(shí)間一致但紫外光譜不同的化合物的干擾。本實(shí)驗(yàn)以陽性樣品和制劑空白中加入氟苯尼考對照品(以回收率試驗(yàn)溶液和檢出限溶液替代)進(jìn)行保留時(shí)間、峰純度檢查和光譜相似度檢查。在與氟苯尼考對照品溶液峰保留時(shí)間一致處出峰，且純度角度小于純度閾值，匹配角度小于匹配閾值，從而證明在該色譜系統(tǒng)條件下，對阿莫西林可溶性粉中非法添加氟苯尼考的檢查方法具有可行性。

本方法建立了HPLC-PDA法檢測阿莫西林可溶性粉中非法添加氟苯尼考的檢查方法，綜合保留時(shí)間、最大吸收波長、峰純度檢查和光譜相似度檢查四方面信息，實(shí)現(xiàn)了獸藥中非法添加物的準(zhǔn)確識別。該方法操作簡便、快速、靈敏度高，為打擊獸藥制劑非法添加氟苯尼考制假行為提供了有力的技術(shù)支持。