UPLC-MS/MS同時測定特殊醫(yī)學用途配方食品中8種真菌毒素

李莉，李碩

（中國食品藥品檢定研究院，北京100050）

0 引言

特殊醫(yī)學用途配方食品由于食用人群的特殊性[1]，質(zhì)量安全問題一直受到消費者的高度關(guān)注。黃曲霉毒素、赭曲霉毒素和雜色曲霉素等真菌毒素，對人體具有潛在的致癌性[2]，如果產(chǎn)品原料質(zhì)量和生產(chǎn)環(huán)節(jié)把控不嚴格，就有可能造成終產(chǎn)品被真菌毒素污染。目前食品中真菌毒素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[3-6]、高效液相色譜法[7-10]、液質(zhì)譜聯(lián)用法[11-15]。液質(zhì)聯(lián)用和快速樣品前處理技術(shù)的聯(lián)合應用[16-19]，具有高靈敏度和優(yōu)異的選擇性，應用優(yōu)勢日益突出。本文建立了直接通過式固相萃取結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)檢測特殊醫(yī)學用途配方食品中8種真菌毒素的方法，該方法簡便快速，可操作性強，可以實現(xiàn)特殊醫(yī)學用途配方食品中多種黃曲霉毒素的同時快速篩查。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LCMS-8060型超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，日本島津公司；AL 204型分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；超聲波清洗器，江蘇昆山市超聲儀器有限公司；渦旋混勻器，美國Scientific Industries公司；CF 16RXII離心機，日本日立公司；MG-2200氮吹儀，日本東京理化公司；超純水純化系統(tǒng)，德國賽多利斯公司。黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、黃曲霉毒素B2(aflatoxin B2，AFB2)、黃曲霉毒素G1(aflatoxin G1，AFG1)、黃曲霉毒素G2(aflatoxin G2，AFG2)、黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1，AFM 1)、黃曲霉毒素M2(aflatoxin M2，AFM 2)混合標準溶液（10μg/mL），青島普瑞邦公司；雜色曲霉素(Sterigmatocystin，ST)標準溶液（50μg/mL），青島普瑞邦公司；赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)標準溶液（10μg/mL），青島普瑞邦公司；乙腈（色譜純），德國默克公司；甲酸（質(zhì)譜級），F(xiàn)isher Scientific公司；Captiva EMR-Lipid萃取管（3 mL），Agilent公司；ISOLUTE Myco固相萃取柱（3 mL），Biotage公司；MPFC-QuEChERS超濾型凈化柱（高脂類），北京綠綿科技有限公司；實驗用水均為超純水；特殊醫(yī)學用途配方食品，市售。

1.2 標準溶液配制

分別準確移取AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM 1、AFM 2混合標準溶液2 mL，ST標準溶液0.2 m L，OTA標準溶液1 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM 1、AFM 2質(zhì)量濃度為2μg/mL、OTA和ST質(zhì)量濃度為1μg/mL的混合標準儲備溶液，-20℃避光保存。臨用時以空白基質(zhì)提取液將上述標準溶液稀釋為系列混合標準工作液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品的提取

精密稱取2.5 g（精確至0.001 g）樣品于50 mL具塞離心管中（對于加標樣品，加入所需體積的標準溶液），加入20 mL乙腈-水(80∶20，v/v)提取溶液，旋渦混勻30 s，室溫下超聲提取30 min，隨后經(jīng)8000 r/min離心5 min，取上清液待凈化。

1.3.2 樣品的凈化

移取上清液2 mL至Captiva EMR-Lipid萃取管，保持每秒1滴的流速，收集全部流出液，氮氣吹干。用0.5 mL乙腈-水溶液（50∶50，v/v）復溶，渦旋混合1 min，過0.22μm聚四氟乙烯微孔濾膜，作為待測溶液。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Aglient Infinity Poroshell 120 SB-C18（100 mm×2.1 mm，2.7μm）；流動相A：A為含有0.1%甲酸的水溶液，B為含有0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，柱溫：40℃，洗脫程序：0～1 min，10%～20%B；1～9 min，20%～40%B；9～10 min，40%～95%B；10～14 min，95%B；14～16 min，10%B。進樣量為5μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描模式：正離子模式；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）模式；霧化氣流量3 L/min，干燥氣流量10 L/min，加熱氣流量10 L/min，DL管溫度250℃，加熱塊溫度400℃，接口溫度300℃，接口電壓4.0 k V。其他質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 各化合物質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

使用各化合物質(zhì)量濃度為100 ng/mL標準儲備液，在ESI離子源條件下采用直接進樣的方式分別進行正負離子掃描。實驗結(jié)果表明8種化合物均在正離子模式下有更好的響應，因此選擇ESI+模式。根據(jù)目標化合物的[M+H]+母離子，在多反應監(jiān)測條件下進一步優(yōu)化質(zhì)譜條件，選擇響應最強的2個子離子，得到使子離子響應最優(yōu)的三重四級桿Q 1和Q 2的電壓以及碰撞能。最終確定的質(zhì)譜多反應監(jiān)測條件參數(shù)如表1所示。

2.2 色譜條件優(yōu)化

由于8種真菌毒素是極性或者弱極性化合物，常用選用C18色譜柱，水與乙腈或甲醇混合作為流動相進行色譜分離。流動相中添加甲酸可提高目標化合物的離子化效率，提高質(zhì)譜檢測的靈敏度。本研究對比了Aglient Poroshell 120 SB-C18柱(2.1 mm×100 mm，2.7μm)、Waters BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)、Waters HSS T 3(2.1 mm×100 mm，1.8μm)柱在以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈為流動相時的分離效果，發(fā)現(xiàn)Aglient Poroshell 120 SB-C18柱更適合8種真菌毒素的快速分析，該柱填充2.7μm實心C18填料，其中實心內(nèi)核為1.7μm，多孔外層為0.5μm，多孔外層和實心內(nèi)核限制了擴散，提高了分離速度，而窄粒徑分布則提高了柱效和分離度，從而得到更好的分離效果和色譜峰峰型。8種真菌毒素總離子流色譜如圖1所示。

圖1 8種真菌毒素總離子流色譜

2.3 提取溶劑的選擇

根據(jù)文獻報道，黃曲霉毒素、雜色曲霉素和赭曲霉毒素常用的提取溶劑為乙腈或甲醇，在乙腈或甲醇中加入適量的水能夠促進溶劑滲透到基質(zhì)內(nèi)部，提高真菌毒素的提取效率。此外，乙腈比甲醇具有較強的蛋白沉淀能力，當樣品基質(zhì)中蛋白質(zhì)含量較多時，選取乙腈-水的混合溶液作為提取溶劑效果更好。因此，本研究以特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品為樣品，通過空白基質(zhì)加標的方式，考察60%乙腈水溶液、70%乙腈水溶液、80%乙腈水溶液和90%乙腈水溶液作為提取溶劑對于待測化合物回收率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，使用80%乙腈水溶液作為提取劑時8種真菌毒素的加標的回收率結(jié)果在64%～89%之間，可以滿足實驗要求。

圖2 不同提取溶液對8種真菌毒素回收率的影響

2.4 樣品凈化方法的選擇

特殊醫(yī)學用途配方食品中蛋白質(zhì)、脂類和糖類等物質(zhì)含量較高，是影響質(zhì)譜測定靈敏度的主要干擾基質(zhì)，因此必須通過適當?shù)膬艋椒右匀コＤ壳俺Ｓ玫膹碗s樣品中真菌毒素的凈化方法有免疫親和柱法、SPE、QuEChERS技術(shù)等，其中免疫親和柱價格昂貴，且只適用于單一或特定的化合物類別或樣品類型，不適合多種毒素的同時測定。本實驗對常規(guī)SPE凈化柱（ISOLUTE Myco）、直接通過式凈化柱（EMR-Lipid萃取管）和QuEChERS凈化技術(shù)（MPFC-QuEChERS）3種不同凈化方法的凈化效果進行了評價，實驗結(jié)果見圖3。分析實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，QuEChERS方法能夠高效、快速的萃取多類別的化合物，但同時也會萃取出大量基質(zhì)（尤其是脂質(zhì)），從而導致雜色曲霉素和赭曲霉毒素A基質(zhì)效應明顯、回收率偏低。常規(guī)的SPE凈化方法對于黃曲霉毒素類化合物的凈化效果要優(yōu)于直接通過式凈化柱和QuECh-ERS方法，但是操作上需經(jīng)過活化、上樣洗脫和淋洗等多個步驟，操作繁瑣，且個別目標物的加標回收率過低，不適用復雜樣品的快速分析。EMR-Lipid萃取管雖然對于黃曲霉毒素類物質(zhì)的加標回收率不如其他兩種凈化方法，但是對于雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的加標回收率要優(yōu)于其他兩種凈化方法，綜合考慮8種目標化合物的結(jié)果，EMR-Lipid萃取管凈化方法的加標回收率均＞60%，滿足實驗要求[19]。此外直接通過式凈化柱無需活化、洗脫和淋洗，可大大縮短凈化時間，因此選擇EMR-Lipid萃取管作為樣品前處理的凈化方法。

圖3 不同凈化方法對8種真菌毒素回收率的影響

2.5 方法研究及結(jié)果分析

2.5.1 線性范圍、回歸方程和檢出限

在質(zhì)譜分析中，基質(zhì)效應會嚴重影響痕量水平目標化合物定量分析的準確性[20]。為了補償基質(zhì)效應對檢測結(jié)果帶來的影響，本研究采用基質(zhì)匹配標準曲線進行目標化合物定量分析。將不含待測物的空白樣品按照1.3步驟進行處理得到空白基質(zhì)溶液，用空白基質(zhì)溶液稀釋混合標準儲備液得到系列濃度的基質(zhì)加標溶液，上機測定。以8種真菌毒素的質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標，定量離子峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。計算目標化合物信號響應和噪聲的比值S/N，得到方法檢出限(limit of detections，LOD，S/N=3)和定量限(limit of quantifications，LOQ，S/N=10)，結(jié)果如表2所示。6種黃曲霉毒素在0.5～20 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)、雜色曲霉素和赭曲霉素A在0.25～10 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r＞0.992，8種真菌毒素的檢出限為0.06～2.1μg/kg，定量限為0.2～2.9μg/kg。

表2 8種真菌毒素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5.2 方法的回收率及精密度

向空白樣品添加低、中、高3個濃度水平的標準溶液進行加標回收試驗，按照方法給出的步驟進行樣品提取、凈化及上機檢測，計算目標化合物的加標回收率。每個加標濃度平行測定6份，用測定結(jié)果的相對標準偏差評價精密度（relative standard deviation，RSD）。回收率和精密度結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，8種真菌毒素的平均回收率為92.2%～108.9%，RSD小于15%。

表3 回收率和精密度實驗結(jié)果（n=6）

2.5.3 實際樣品檢測

按照本實驗建立的方法對購自不同產(chǎn)地和廠家的15份特殊醫(yī)學用途配方食品進行檢測，15批樣品中均未檢出8種真菌毒素。

3 結(jié) 論

本研究建立了采用新型固相萃取前處理方法結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測技術(shù)同時測定特殊醫(yī)學用途配方食品中多種類真菌毒素的快速篩查方法。直接通過式EMR-Lipid萃取管省去了常規(guī)萃取柱活化、洗脫和淋洗的步驟，可大大縮短凈化時間，提高檢測的效率，可以實現(xiàn)批量樣品的快速檢測。該方法簡化了分析步驟，操作簡便快捷，同時具有良好的準確度和精密度，能滿足特殊醫(yī)學用途配方食品中真菌毒素污染水平的監(jiān)測和產(chǎn)品質(zhì)量控制工作的需要。