高效液相色譜法測定吉如和米斯-5 丸中胡椒堿含量

楊宇慧，周智臣，王曉東，寶山，那松巴以拉，青松，成志平

（1 包頭市食品藥品檢驗檢測中心，內蒙古 包頭；2 內蒙古國際蒙醫醫院，內蒙古 呼和浩特）

0 引言

吉如和米斯-5 丸是一種復方制劑，由五味藥（蓽茇、肉豆蔻、木香、丁香、廣棗等）組成，用于心煩失眠，心神不安。有研究表明，蓽茇對癌癥、糖尿病、炎癥和肥胖癥等有較好的療效[1,2]。此外，蓽茇還有心臟保護、抗輻射所致的損傷和抗感染作用。參考文獻[3]及相關研究將胡椒堿作為蓽茇的質量控制指標[1，2]。本研究中采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）法 測定吉如和米斯-5 丸中胡椒堿含量，以提高其質量標準[3-7]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-10A 液相色譜儀（包括SPD-10A 型檢測器，CLASSVP 色譜工作站；VU-2201 紫外可見分光光度計）；AE163 電子天平；AE100 電子天平。

1.2 試劑與試藥

胡椒堿對照品（批號：110775-201706，純度98.9%）中國食品藥品檢定研究院；樣品由內蒙古國際蒙醫醫院提供（批號分別為201900607、20190948、20200124）。甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，本實驗采ODS-2HYPERSIL（250mm×4.6mm，5μm）。柱 溫30 ℃；檢測波長343nm；流速1.0ml/min；進樣量10μl；流動相：甲醇-水（70 ∶30）。

2.2 溶液制備

對照品溶液：精密稱取胡椒堿對照品15.78mg，置50ml 棕色量瓶中，加無水乙醇使溶解，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取3ml，置25ml 棕色量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，配置成含胡椒堿質量濃度為37.46μg/ml的對照品溶液。

供試品溶液：取本品適量，研細，取約0.8g，精密稱定，置50ml 棕色量瓶中，加無水乙醇40ml，超聲處理30min，放冷，加無水乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：按樣品處方比例，稱取缺蓽茇的其余藥材，并按生產工藝制備缺蓽茇的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺蓽茇的陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：準確吸取上述溶液各10μl，根據色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜相應位置上有相同保留時間的色譜峰，而陰性對照無干擾，表明專屬性良好。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關 系考察：精密吸 取1μl、2μl、4μl、6μl、8μl、12μl、20μl 進樣，按上述色譜條件進行測定，以胡椒堿質量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標。繪制標準曲線，得胡椒堿回歸方程Y=9 456.847015X-5 350.703684（R2=0.99999）。表 明，胡椒堿 在37.46-749.20ng 范圍內呈良好的線性關系。

精密度試驗：精密吸取（批號：20190607）供試品溶液10μl，按上述色譜條件連續進樣6 次，胡椒堿峰面積的RSD 為0.5%，說明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批（批號：20190948）樣品，依法制備供試品溶液，分別于0h、4h、8h、12h、24h 時按擬訂色譜條件進樣測定。結果胡椒堿峰面積的RSD 為0.1%(n=5)，表明供試品溶液24h 內穩定性良好。

重復性試驗：取同一供試品（批號20190607）6 份，按正文供試品制備方法制備樣品，照HPLC 法（《中國藥典》2015 年版四部通則0512），在343nm 波長處測定峰面積，按外標峰面積計算。測定每份樣品的含量，RSD%為1.7%，表明該方法重現性良好。

準確度試驗：加樣回收試驗，取供試品（批號20190607，含量0.4994mg/g）6 份，按已知量的100%加入胡椒堿對照品，按正文供試品制備方法制備樣品，照HPLC法（《中國藥典》2015 年版四部通則0512），在343nm 波長處測定峰面積，按外標峰面積計算。結果胡椒堿平均回收率為97.0%，RSD 為0.86%。

耐用性試驗換不同廠家、不同型號的色譜柱，取供試品（批號：20190607）精密稱定，按正文供試品制備方法制備樣品，照HPLC 法（《中國藥典》2015 年版四部通則0512），在343nm 波長處測定峰面積，按外標峰面積計算，測定含量，RSD%為0.5%。

2.4 樣品含量測定

樣 品(批號分別為201900607、20190948、20200124)，依法制備供試品溶液，分別進樣10μl，按擬訂色譜條件進樣測定，計算樣品中胡椒堿的含量。結果3 批樣品中胡椒堿含量分別為0.523mg/g、0.499mg/g、0.534mg/g，平均含量為0.519mg/g。

3 討論

3.1 檢測波長選擇

取胡椒堿對照品溶液，于紫外可見分光光度儀上，自200-700nm 波長內做光譜掃描，胡椒堿在波長為343nm處有最大吸收，且在343nm 波長處得到的峰形、峰高最適宜，故選擇343nm 作為檢測波長[8-10]。

3.2 流動相選擇

參照文獻[3]蓽茇項下，以甲醇-水（77 ∶23）作為流動相進行測定，結果胡椒堿峰保留時間短，分離效果不好，當將流動相比例調整為甲醇-水（70 ∶30）時，樣品中的胡椒堿具有更好的分離度和更長的保留時間[11,12]。

3.3 提取溶劑和提取時間確定

按照文獻[3]中蓽茇含量的測定方法，通過超聲提取無水乙醇制備待測溶液。為了充分提出要測量的組分，本研究調查了在超聲處理20min、30min、40min 時的同一批樣品中待測量成分的含量隨時間的變化。結果表明，在30min 和40min 時，待測成分的含量沒有顯著變化。因此，超聲處理時間確定為30min。

3.4 方法評價

結果表明：對于本研究而言，HPLC 法高效、準確、可靠，所選指標成分與制劑的主要藥味和功能主治接近，可為完善吉如和米斯-5 丸的質量控制提供參考[8]。