姜黃素衍生物通過Notch1/Hes1信號通路抑制RSV感染后人肺上皮細胞MUC5AC分泌的研究

葉文靜 翁婷婷 王樂穎 李海燕 陳小芳 董琳

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）是嬰幼兒急性下呼吸道感染的主要病原體[1]。RSV感染后氣道上皮細胞黏蛋白5AC（mucin-5AC,MUC5AC）水平升高，引發氣道黏液過度分泌進而導致氣道阻塞[2]。研究發現，RSV感染后氣道上皮細胞高表達的IL-25可促進IL-5、IL-13等細胞因子的分泌導致黏液過度分泌[3]。RSV可通過活化Notch1信號通路加重氣道炎癥[4]，而Notch通路特異性拮抗劑——γ分泌酶抑制劑（γ secretaseinhibitor,DAPT）能下調肥胖哮喘小鼠MUC5AC的高表達[5]。發狀分裂相關增強子1（hairy enhancer of split 1,Hes1）是Notch1信號通路常見的靶基因，Notch1/Hes1信號通路能激活RSV感染后Th2型免疫反應[4]，但對IL-25的調控作用尚未見報道。姜黃素具有抑制體內氣道上皮細胞MUC5AC水平升高的作用[6-7]，并可下調Notch1通路改善氣道炎癥[8]，但其對氣道黏液高分泌的調控效應及具體機制尚不清楚。單羰基姜黃素衍生物B6的生物利用度較天然姜黃素明顯提高[9]，對于脂多糖誘導的肺部炎癥有良好的抑制作用[10]。本研究通過檢測 RSV感染及 B6、DAPT、地塞米松（dexamethasone,DXM）干預后人肺上皮細胞 Notch1、Hes1、MUC5AC mRNA和蛋白表達及IL-25蛋白水平變化，探討RSV感染氣道黏液高分泌的調控機制及姜黃素衍生物的干預效應，以期為臨床應用姜黃素衍生物治療RSV感染提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 人喉癌細胞Hep-2細胞株和人肺上皮細胞BEAS-2b細胞株均采購于美國模式菌種收集中心；RSV國際標準株Long株來自北京市兒科研究所感染與病毒研究室；均保存于-80℃冰箱中。B6（溫州醫科大學藥學院惠贈）、DAPT（上海藍木化工有限公司，規格：10 mmol/L，批號：06）及 DXM（北京索萊寶科技公司，規格：100 mg，批號：530D056）均溶于二甲基亞砜溶液中（北京索萊寶科技公司，規格：100 ml，批號：1213C0226），分別配成 0.1 mmol/L、0.1 mmol/L 及 10 mg/ml的母液，使用時用培養液稀釋成造模所需的濃度。

1.2 實驗方法

1.2.1 BEAS-2b和Hep-2細胞培養 將細胞接種于培養瓶中，用DMEM培養基配制的培養液培養，置于5%CO2、飽和濕度、37℃的恒溫培養箱中生長，待細胞長滿至90%左右時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代；隔天換液1次，待80%～90%的細胞融合時進行下一步操作。

1.2.2 RSV增殖培養 將凍存的RSV Long株復蘇，接種于長滿至80%左右Hep-2細胞上，病毒培養箱培養吸附2 h后再加入DMEM配制的維持液，繼續培養，觀察細胞病變情況，待出現75%以上細胞融合病變（約需2～3 d），再將培養瓶置-20℃冰箱凍存2 h以上，37℃水浴箱融化，反復3次，再5 000 r/min離心15 min，棄沉淀，收集病毒上清液，每管1 ml分裝，置-80℃冰箱保存待用。

1.2.3 RSV滴度測定 將Hep-2細胞以1×105/ml的濃度每孔100 μl接種于96孔培養板上。用維持液按10倍稀釋法稀釋病毒原液，稀釋成10-1～10-9。待細胞長滿，PBS洗3遍，再接種上述濃度的病毒液，每個濃度重復8孔，同時設細胞對照組。置于病毒培育箱中吸附2 h，再加維持液繼續培養。觀察細胞病變效應（cytopathic effect,CPE）的情況并記錄，用Reed-Muench公式計算病毒的半數感染量（50%tissue culture infectious doses,TCID50）。病毒攻擊量為100 TCID50。TCID50=CPE＞50%病毒稀釋度lg10（CPE的記錄方法為：無CPE記為“-”；≤25%細胞出現病變記為“+”；＞25%～50%細胞病變記為“++”；＞50%～75%細胞病變記為“+++”；＞75%～100%的細胞病變記為“++++”）。

1.2.4 藥物細胞毒性測定 按CCK-8試劑盒說明書，將BEAS-2b細胞接種于96孔板中。利用細胞培養液稀釋 B6、DAPT、DXM、DMSO，分別配制成 10～50 μmol/L B6，10～50 μmol/L DAPT，0.01 ～0.05 mg/ml DXM、0.1%DMSO。待細胞生長至80% ，每孔加入100 μl配制好的不同濃度的藥物，每種藥物的每個濃度處理孔、正常細胞對照孔及空白孔均設6個復孔，置培養箱中分別培育12、24 h后，PBS洗板3次，每孔重新加入新鮮的培養液，再向每孔加入10 μl的CCK-8試劑，置培養箱中孵育30min～3 h。多功能酶標儀測定450 nm處的吸光度（A），并記錄。細胞存活率=（藥物孔A450-空白孔A450）/（細胞對照孔A450-空白孔A450）×100%。

1.2.5 實驗分組 于6孔板中接種已傳代培養的BEAS-2b，隨機分成以下6組：B6組、DAPT+B6組、DAPT組、DXM組、RSV組和細胞對照組。B6組在RSV感染造模0.5 h前予10 μmol/L B6預處理，DAPT+B6組在B6預處理前先以20 μmol/L DAPT預處理1 h。造模開始前1 h，DXM 組加入 0.01 mg/ml DXM。B6組、DAPT+B6組、DAPT組、DXM組以及RSV組以100倍TCID50濃度的RSV進行感染吸附BEAS-2b 2 h，再加維持液繼續培養12、24 h取細胞及上清液進行檢測。

1.2.6 RT-PCR檢測 Notch1、Hes1和 MUC5AC mRNA表達 以Trizol法提取培養細胞的總RNA，逆轉錄合成cDNA。引物序列：人Notch1上游引物：5'-GCTGGACTGTGCGGAGCATGTA-3'，下游引物：5'-GGAAGATCATCTGCTGGCCGTG-3'； 人 Hes1上 游 引 物 ：5'-GAGAGGCGGCTAAGGTGTTT-3'，下游引物：5'-GTGTAGACGGGGATGACAGG-3'；人MUC5AC上游引物：5'-GGCCATA CACGGGCACAATCT-3'，下游引物：5'-CATCACCTTCGACGGCACCTA-3'；人GAPDH上游引物：5'-GGAGAAGGCTGGGGCTCAT-3'，下游引物：5'-TGGGTGGCAGTGATGGCA-3'。參照試劑盒配置RTPCR反應體系，將上述配好的體系加入8連管中，每組3個復孔，置于熒光定量PCR儀內；預變性95℃2 min→變性95℃10 s→退火60℃40 s（循環40次）；PCR擴增結束后，保存數據，建立產物的熔解曲線并進一步分析。

1.2.7 Western blot檢測Notch1、Hes1和MUC5AC蛋白表達 各組細胞培養至約80%時用預冷的PBS漂洗，再加入RIPA裂解液，冰上提取蛋白質。用BCA法測定蛋白濃度，配置上樣樣品。每孔20 μl上樣，10%SDSPAGE電泳，轉膜，5%脫脂牛奶中封閉2 h，1∶1 000第一抗體4℃搖床孵育過夜；第二抗體常溫孵育2 h，加ECL發光試劑，曝光機顯影分析。

1.2.8 ELISA檢測IL-25蛋白水平 收集造模后的細胞上清液于無菌EP管內，根據ELISA試劑盒說明書進行操作，于酶標儀450 nm測定各孔吸光度，并用軟件計算蛋白水平。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RSV滴度測定 本實驗RSV的TCID50為10-4.8/50 μl，病毒攻擊量為 100 TCID50，即 10-2.8/50 μl。

2.2 B6、DAPT、DXM及0.1%DMSO的細胞毒性 10μmol/L B6、20 μmol/L DAPT、0.01 mg/ml DXM 和 0.1%DMSO處理后12、24 h兩個時間點BEAS-2b細胞存活率分別98.01% 、97.78% ；98.57% 、98.22% ；98.61% 、98.30% 和99.20%、98.79%，與細胞對照組相比差異均無統計學意義（均P＞0.05），表明上述濃度的藥物對BEAS-2b細胞無明顯毒性反應。

2.3 各組細胞Notch1 mRNA及蛋白表達水平比較 細胞對照組Notch1 mRNA和蛋白表達水平最低，與細胞對照組相比，B6組、DAPT+B6組、DAPT組以及RSV組Notch1 mRNA及蛋白表達水平在RSV感染后12、24 h兩個時間點均顯著升高（均P＜0.05）；與RSV組相比，兩個時間點其他組Notch1 mRNA及蛋白表達水平均有所降低（均P＜0.05），以DXM組表達水平最低；而B6組、DAPT+B6組以及DAPT組同一時間點表達水平相近，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖1、2。

圖1 各組細胞呼吸道合胞病毒（RSV）感染后12、24 h Notch1 mRNA表達水平比較（A：B6組；B：DAPT+B6組；C：DAPT組；D：DXM 組；E：RSV 組；F：細胞對照組；與F組比較，*P＜0.05；與 E 組比較，△P＜0.05；n=3）

圖2 各組細胞呼吸道合胞病毒（RSV）感染后12、24 h Notch1蛋白表達水平比較（A：B6組；B：DAPT+B6組；C：DAPT組；D：DXM組；E：RSV組；F：細胞對照組；與 F 組比較，*P＜0.05；與E組比較，△P＜0.05；n=3）

2.4 各組細胞Hes1 mRNA及蛋白表達水平比較 細胞對照組Hes1 mRNA和蛋白表達水平最低，與細胞對照組相比，B6組、DAPT+B6組、DAPT組以及RSV組Hes1 mRNA和蛋白表達水平在RSV感染后12、24 h兩個時間點均顯著升高（均P＜0.05）；與RSV組相比，兩個時間點其他組Hes1 mRNA和蛋白表達水平均降低（均P＜0.05），以DXM組表達水平最低；而B6組、DAPT+B6組以及DAPT組同一時間點表達水平相近，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖3、4。

圖3 各組細胞呼吸道合胞病毒（RSV）感染后12、24 h發狀分裂相關增強子 1（Hes1）mRNA 表達水平比較（A：B6組；B：DAPT+B6組；C：DAPT組；D：DXM 組；E：RSV 組；F：細胞對照組；與 F 組比較，*P＜0.05；與 E 組比較，△P＜0.05；n=3）

圖4 各組細胞呼吸道合胞病毒（RSV）感染后12、24 h發狀分裂相關增強子 1（Hes1）蛋白表達水平比較（A：B6組；B：DAPT+B6組；C：DAPT 組；D：DXM 組；E：RSV 組；F：細胞對照組；與 F 組比較，*P＜0.05；與 E 組比較，△P＜0.05；n=3）

2.5 各組細胞MUC5AC mRNA及蛋白表達水平比較細胞對照組MUC5AC mRNA和蛋白表達水平最低，與細胞對照組相比，B6組、DAPT+B6組、DAPT組以及RSV組MUC5AC mRNA和蛋白表達水平在RSV感染后12、24 h兩個時間點均顯著升高（均P＜0.05），24 h升高更明顯。與RSV組相比，兩個時間點其他組MUC5AC mRNA和蛋白表達水平均降低（均P＜0.05），以DXM組表達水平最低；而B6組、DAPT+B6組以及DAPT組同一時間點表達水平相近，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖 5、6。

圖5 各組細胞呼吸道合胞病毒（RSV）感染后12、24 h黏蛋白5AC（MUC5AC）mRNA 表達水平比較（A：B6組；B：DAPT+B6組；C：DAPT組；D：DXM組；E：RSV 組；F：細胞對照組；與 F 組比較，*P＜0.05；與 E 組比較，△P＜0.05；n=3）

圖6 各組細胞呼吸道合胞病毒（RSV）感染后12、24 h黏蛋白5AC（MUC5AC）蛋白表達水平比較（A：B6組；B：DAPT+B6組；C：DAPT 組；D：DXM 組；E：RSV 組；F：細胞對照組；與 F 組比較，*P＜0.05；與 E 組比較，△P＜0.05；n=3）

2.6 各組細胞IL-25蛋白水平比較 細胞對照組IL-25水平最低，與細胞對照組相比，其他組IL-25水平明顯增高（P＜0.05）。與RSV組相比，感染RSV后12、24 h兩個時間點B6組、DAPT+B6組、DAPT組以及DXM組IL-25水平均明顯降低（均P＜0.05），其中DXM組蛋白水平最低；而B6組、DAPT+B6組以及DAPT組同一時間點水平相近，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組細胞RSV感染后12、24 h IL-25蛋白水平比較

3 討論

體內外研究已證實RSV感染后會導致氣道黏液高分泌，MUC5AC表達明顯增加[2]。本實驗結果與以上結論相一致，RSV感染BEAS-2b細胞后，MUC5AC mRNA及蛋白表達水平均顯著增加，與感染后12 h相比，24 h表達水平增加更明顯，具有時間依賴性。Notch1信號通路可能在氣道黏液高分泌的調控中發揮重要作用，但存在復雜的作用機制且正負效應尚未明確[11-12]。已有研究發現，RSV感染支氣管上皮細胞可以活化Notch1信號通路，進而促進氣道微環境中Th2淋巴細胞的分化[4]。故本研究選擇Notch1/Hes1信號通路，探討其在RSV感染MUC5AC高表達中的作用。

本研究結果顯示，RSV感染BEAS-2b 12、24 h后，Notch1、Hes1的表達水平明顯升高，支持RSV感染可激活Notch1信號傳導通路這一推測。但與感染后12 h相比，感染后24 h Notch1、Hes1表達上調作用未見明顯增加，提示需延長作用時間以進一步明確其時間依賴性。結果進一步顯示RSV感染后IL-25的表達增加，趨勢與Notch1、Hes1相平行。RSV感染后，DAPT干預組的Notch1、Hes1及IL-25表達明顯減少，表明抑制Notch1/Hes1信號通路能下調IL-25的釋放，提示Notch1信號通路參與調控RSV感染后IL-25的高表達。同時，DAPT干預組MUC5AC mRNA表達及蛋白水平均較病毒對照組明顯下降，提示DAPT可以抑制RSV感染后MUC5AC的高表達。上述結果表明，抑制Notch1/Hes1信號傳導通路介導的IL-25釋放可以下調MUC5AC表達。

Yang等[13]研究發現姜黃素可以抑制Notch1/Hes1信號通路進而減輕內皮細胞氧化應激損傷。本研究中，與RSV感染組相比，姜黃素衍生物B6干預組Notch1、Hes1表達水平明顯降低，提示B6對RSV感染后Notch1/Hes1信號通路的活化具有抑制作用。同時，B6干預組的MUC5AC mRNA及蛋白表達水平和IL-25蛋白水平明顯降低，提示B6可通過下調MUC5AC及IL-25表達從而抑制RSV感染導致的氣道黏液高分泌，與文獻報道一致[7，14]。B6與DAPT作用類似，但DAPT預處理后再加B6干預組的上述指標表達水平下降與B6或DAPT單獨干預組相比無統計學差異，提示預處理的DAPT可能拮抗了B6的作用，B6的作用機制可能與DAPT相同。DXM具有強大的抗炎功能，能抑制血管內皮生長因子誘導的支氣管上皮細胞MUC5AC的高表達[15]。本實驗以DXM作為陽性對照，結果發現DXM干預組Notch1、Hes1、MUC5AC及IL-25蛋白表達均明顯下降，其中對Hes1表達的抑制效應最為明顯，此與Revollo等[16]報道的糖皮質激素能迅速而穩定地沉默Hes1的研究結論相一致。與DXM干預組相比，B6干預組上述指標表達水平下降不明顯，提示B6的抑制效應弱于DXM。

綜上所述，RSV感染可激活Notch1/Hes1信號通路，進而通過上調IL-25的釋放參與調控氣道黏液高分泌，而姜黃素衍生物對此具有抑制效應。本研究為姜黃素衍生物應用于RSV感染的治療提供實驗依據，深化了對姜黃素衍生物抗炎及免疫調節機制的認識。