miR205-3p靶向MDM2調控乳腺癌血管內皮細胞增殖的研究

周少丞 季曉春 滕偉峰 張佳男 毛琦淇

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。在全世界范圍內，乳腺癌約占女性惡性腫瘤總發病率的25%，女性腫瘤相關死亡率的15%[1]。腫瘤的生長、侵襲及轉移與血管生成密不可分。由于在腫瘤微環境的影響下，腫瘤血管在形態、功能、基因表達上與正常的血管存在著較大的差異[2]。因此，如何有效地控制腫瘤血管的生長對治療乳腺癌具有重要意義。miRNA作為廣泛存在于真核生物中的一類長度為18～26個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，通過與靶mRNA的3'UTRs互補結合，在轉錄水平降解mRNA或者在翻譯水平抑制蛋白質的合成，從而達到調控基因表達的作用。miR205最初是在研究鼠和紅鰭東方豚的同源序列時通過在線預測網站MiRscan預測發現的，之后證實在人體中也有表達。miR205與多種腫瘤的發生、發展相關，在不同的腫瘤中其表達水平不同，如在前列腺癌[3]中低表達，在非小細胞肺癌[4]、黑色素瘤[5]及頭頸部鱗癌[6]等腫瘤中高表達。鼠雙微體2基因（mouse double minute 2,MDM2）作為一種進化相對保守的基因，通過調節p53的功能影響細胞周期起到重要作用。miR205-3p在BC-ECs中的表達情況鮮有報道，且miR205-3p能否通過調控MDM2的表達參與對乳腺癌血管內皮細胞（breast cancer-endothelial cells,BC-ECs）增殖的影響尚不明確。基于此，本研究旨在分析miR205-3p調控BC-ECs增殖的作用機制，探討乳腺癌臨床治療可行的分子靶點，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 3種乳腺癌細胞株（MCF7、MDA-MB-453、MDA-MB-231）和人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。NOD SCID小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 主要試劑和儀器 RPMI 1640培養基、DMEM培養基均購自美國Gibco公司。EGM血管內皮細胞專用培養基購自瑞士Lonza公司。FBS購自美國Gibco公司。Lipofectamine 3000轉染試劑購自美國Invitrogen公司。Matrigel基質膠購自美國BD公司。無菌超凈工作臺購自中國蘇州金凈有限公司。細胞CO2恒溫培養箱購自美國Thermo Fisher公司。小型臺式離心機購自德國Eppendorf公司。細胞T25培養瓶購自美國Corning公司。超低吸附六孔板購自美國Corning公司。六孔板購自美國Costar公司。μ-Slide血管生成培養板購自德國ibidi公司。2.5 μl、10 μl、20 μl、100 μl、1 ml移液槍均購自美國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 3種乳腺癌細胞株和HUVEC使用含10%FBS、100 μg/ml鏈霉素和 100 U/ml青霉素的 RPMI 1640或DMEM完全培養基，置于5%CO2的37°C恒溫培養箱內培養。待細胞貼壁生長超過80%后，利用胰淀粉酶進行消化后傳代或凍存。

1.3.2 建模與BC-ECs提純 3種乳腺癌細胞種植于小鼠背部皮下，成瘤后的乳腺癌組織分別剪成0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm的小塊，加入含0.1%膠原酶Ⅰ的無血清RPMI 1640培養基震蕩消化，經過濾、洗滌后加入抗CD105抗體交聯免疫磁珠。細胞懸液加入分選柱進行分選，收集被磁珠標記的陽性細胞再進行培養，最終得到BC-ECs。

1.3.3 免疫組織熒光檢測CD105及CD31蛋白表達成瘤后的乳腺癌組織甲醛固定后，制作石蠟切片，脫蠟、修復后分別用抗CD105抗體和抗CD31抗體4°C孵育過夜，第2天沖洗后，分別用FITC標記的二抗和羅丹明標記的二抗避光孵育，再次沖洗后進行細胞核DAPI染色，熒光鏡下觀察。

1.3.4 血管內皮細胞成管實驗 實驗前1 d將Matrigel基質膠于4°C融化。實驗時在μ-Slide血管生成培養板的每個孔中加入10 μl Matrigel。然后將μ-Slide板放入培養皿中，加入吸滿水的吸水紙以防止μ-Slide板中水分蒸發。培養皿在培養箱中放置30 min使膠凝固；同時開始準備細胞懸液，即BC-ECs和HUVEC，細胞消化后將細胞懸液濃度調整為2×105個/ml；取出μ-Slide板，每孔加入50 μl細胞懸液，然后放入培養箱繼續培養，每隔4～6 h用光學顯微鏡拍攝實驗結果。

1.3.5 血管內皮細胞吞噬實驗 將BC-ECs和HUVEC分別接種于24孔板中，培養48 h；吸去培養基，用無血清的EGM血管內皮細胞培養基培養3 h；加入無血清的EGM培養基配制的DiI標記的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-ac-LDL）（10 μg/ml），37 °C 孵育 4 h；吸去培養基，PBS漂洗3次，去除未結合的DiI-ac-LDL；加入完全培養基，熒光顯微鏡觀察。

1.3.6 實時熒光定量PCR檢測miR205-3p表達 提取3種細胞成瘤組織中的BC-ECs及HUVEC的總RNA，反轉錄成cDNA，反應體系20 μl，反應條件16℃30 min，45℃ 30 min，85℃ 5 min。運用 SYBR Green法檢測miR205-3p的表達情況，運用反應條件94℃15 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環40 次；最后 72 ℃延伸6 min。每組樣品重復3次，試驗重復3次，統計分析標本中miR205-3p的表達情況。

1.3.7 熒光素酶報告基因檢測 利用靶基因預測數據庫 Target Scan網站（http://www.targetscan.org）預測miR205-3p的靶基因。發現miR205-3p的5'端可與MDM2 mRNA的3'UTR區特異性結合，推測MDM2是miR205-3p的靶基因。為驗證這一預測，構建突變型MT-MDM2和野生型WT-MDM2的MDM2的3'-UTR熒光素酶報告基因載體，利用Lipofectamine 3000將miR205-3p和miR-NC（陰性對照）分別與MT-MDM2和WT-MDM2共轉染MDA-MB-231細胞中，然后將各組MDA-MB-231細胞培養48 h，收集各組細胞，通過雙熒光素酶報告檢測試劑盒（美國Promega公司）檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.3.8 Western blot檢測MDM2蛋白的表達 提取組織總蛋白，SDS-PAGE分離蛋白，電轉移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉后，加入一抗（MDM2 1∶200）4 °C孵育過夜。TBST洗膜3次，接著加入辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育1 h后，再用TBST洗膜。最后進行顯影拍照。

1.3.9 MTT實驗檢測細胞增殖能力 將BC-ECs分成3組，空白對照組（Mock組）、陰性對照組（miR-NC組）和實驗組（miR205-3p組），接種于96孔板中，培養24、48、72 h，每個時點每孔加入20 μl MTT試劑后繼續培養4 h吸出培養基，再加入150 μl DMSO試劑，檢測各孔570 nm處的吸光值。

1.3.10 乳腺癌小鼠移植瘤模型建立 將小鼠20只隨機分成Blank組（空白對照組）和miRNA激動劑miR205-3p agomir組（實驗組），每組10只。將MDA-MB-231制備成1×107/ml的細胞懸液，接種于每只小鼠背部皮下。同時，尾靜脈分別注射0.9%氯化鈉注射液或miR-205-3p agomir 2 nmol，注射1次/4 d，觀察成瘤時間，每周測量小鼠瘤體大小，計算腫瘤體積，繪制生長曲線，28 d后處死小鼠，獲得腫瘤組織。腫瘤體積=長徑×短徑2×0.5（cm3）。

1.4 觀察指標 （1）驗證分選所得的BC-ECs的純度及其內皮細胞生物學功能。（2）驗證生物信息學預測得到miR205-3p的靶基因MDM2，并通過改變miR205-3p的表達水平，是否可以改變BC-ECs的生物學功能。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌移植瘤中人源性血管內皮細胞表面標記物的表達、BC-ECs的提純及其內皮細胞生物學功能檢測結果 將乳腺癌細胞株（MDA-MB-231）細胞懸液種植于NOD SCID小鼠背部皮下后形成移植瘤，通過免疫熒光實驗，可見人源性內皮細胞表面標志物CD105和CD31的表達（圖1，見插頁）。

圖1 免疫熒光檢測MDA-MB-231成瘤組織中人源性血管內皮表面標記物CD105和CD31的表達（×100）

通過抗CD105磁珠分選，從MDA-MB-231移植瘤組織中純化得到BC-ECs，鏡下可見其與HUVEC均呈鵝卵石樣形態（圖2a，見插頁）。運用內皮細胞成管實驗和內皮細胞吞噬實驗對BC-ECs和HUVEC進行內皮細胞功能鑒定。結果發現BC-ECs和HUVEC能在Matrigel膠上形成管腔樣結構（圖2b，見插頁），并能夠吞噬ac-LDL后發出紅色熒光（圖2c，見插頁）。

圖2 乳腺癌血管內皮細胞（BC-ECs）和人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）細胞形態及內皮細胞生物學功能檢測[a：光鏡下所見（×400）；b：內皮細胞成管實驗光鏡下所見（×200）；c：內皮細胞吞噬實驗光鏡下所見（×400）]

2.2 BC-ECs miR205-3p表達水平檢測結果及靶基因的預測、鑒定結果 實時熒光定量PCR檢測3種乳腺癌細胞（MDA-MB-231、MDA-MB-453及 MCF-7）成瘤組織中的BC-ECs及HUVEC miR-205-3p的表達情況，結果發現BC-ECs中miR205-3p的表達水平相比HUEVC 明顯降低（P＜0.05，圖 3）。

圖3 在乳腺癌血管內皮細胞（BC-ECs）與人臍靜脈內皮細胞內皮細胞（HUVEC）的miR205-3p表達水平比較（*P＜0.05）

根據Target Scan生物軟件分析，發現miR205-3p與MDM2的3'UTR區有一處高度匹配，位于62～68位置（圖4a）。野生型MDM2基因熒光素酶表達載體WTMDM2與miR205-3p共轉染MDA-MB-231細胞后，miR205-3p組MDA-MB-231細胞熒光素酶活性較miR-NC組顯著降低（P＜0.05），而突變型MDM2基因熒光素酶表達載體MT-MDM2和miR-205-3p共轉染MDA-MB-231細胞后，miR-205-3p組MDA-MB-231細胞熒光素酶活性較miR-NC組差異無統計學意義（P＞0.05）（圖4b），證實MDM2為miR205-3p的潛在靶點，miR205-3p可負性調控MDM2的表達。

圖4 miR205-3p與鼠雙微體2基因（MDM2）3'UTR區結合（a：生物信息學分析miR205-3p與MDM2的3'UTR區結合位點；b：熒光素酶報告基因實驗證實miR205-3p與靶基因MDM2的3'UTR 區結合，*P＜0.05）

2.3 BC-ECs過表達miR205-3p后MDM2蛋白表達及增殖能力變化 Western blot檢測結果顯示過表達miR205-3p后，MDM2在BC-ECs中表達降低（圖5a）。同時，轉染miR205-3p后，BC-ECs的增殖能力在同時間段檢測時的OD值明顯低于陰性對照組及空白對照組，差異具有統計學意義（圖5b）。

圖5 miR205-3p靶向鼠雙微體2基因（MDM2）影響BC-ECs的增殖能力（a：BC-ECs中MDM2蛋白表達電泳圖；b：3組BC-ECs增殖能力比較，*P＜0.05）

2.4 注射miR205-3p agomir對體內移植瘤生長的影響接種28 d后測量移植瘤體積空白對照組和miR205-3p agomir組分別為（1.19±0.14）cm3和（0.54±0.09）cm3。miR205-3p agomir組移植瘤體積明顯小于空白對照組（P＜0.05，圖 6）。

圖6 注射miR205-3p激動劑對體內移植瘤生長的影響（a：移植瘤體積生長曲線圖；b：實驗組和對照組的移植瘤組織照片）

3 討論

乳腺癌是我國女性發病率第一位的惡性腫瘤[7]。乳腺癌的發生、發展過程中伴隨著大量功能基因表達的變化、表觀遺傳學的變化及多種分子交互作用的變化。因此，探討乳腺癌發生與發展過程中的分子作用機制對其提高治療效果、改善預后起到十分重要的作用。

miRNA是一類長度為22個核苷酸，可以在轉錄水平調控基因標的的非編碼RNA[8]。近年來，大量的研究發現miRNA作為癌基因或抑癌基因調節腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲及凋亡，參與到腫瘤的發生、發展和轉移的過程中，在癌癥的發病機制、早期診斷、治療及預后中起到了重要的生物學功能調控作用。miR-205位于人染色體（1q32.2）LOC642587基因座中的第2個內含子中，在腦膠質瘤的研究中發現，過表達miR205可通過靶向調控TBX18，抑制其侵襲能力，起到抑癌的作用[9]。在前列腺癌中，提高miR205的表達可靶向ZEB1基因來抑制前列腺癌細胞的侵襲和轉移[10]。也有研究發現，過表達miR205可抑制E-鈣黏蛋白的表達，同時激活AKT和下調GSK-3β促進Snail蛋白的表達，達到抑制子宮內膜癌的侵襲和轉移[11]。在乳腺癌的相關研究中，miR205的表達通常都是降低的。有研究顯示，高轉移性乳腺癌中miR205的表達水平相對于低轉移乳腺癌細胞更低[12]。在三陰性乳腺癌的研究中發現，miR205在三陰性乳腺癌細胞中表達極低，當過表達miR-205后，三陰性乳腺癌細胞的侵襲及遷移能力均下降，其機制在于miR205負向調控整合素α5，抑制Src/Vav2/Rac1途徑，降低癌細胞的惡性生物學功能[13]。綜上研究可以發現，miR205在乳腺癌細胞的發生、發展中具有密切的相關性。

但是，miRNA在腫瘤血管中的研究卻鮮有報道。1971年，Folkman等[14]首次提出了腫瘤生長的血管依賴性，血管生成是腫瘤生長的必要條件，腫瘤發生后進一步生長必須依賴血管的生成。Endoglin（CD105）是一種表達于增殖活躍的內皮細胞的同型二聚體跨膜糖蛋白[15]。眾多研究表明，CD105涉及血管的生成，認為是一種腫瘤血管內皮細胞表面非常特異性的標志物[16-17]。通過免疫組化染色結果表明：在乳腺癌、非小細胞肺癌、宮頸癌等惡性腫瘤組織中，采用Endoglin標記微血管密度明顯優于CD31、CD34等相關抗原標記的結果，可作為獨立的預后指標[18-19]。因此，本研究選用CD105作為腫瘤來源的血管內皮細胞的特異性表面標志物，從乳腺癌皮下成瘤組織中提純得到的CD105+細胞（即BC-ECs），通過鏡下觀察、成管實驗和內皮細胞吞噬實驗證實其具有內皮細胞功能；接著通過實時熒光定量PCR檢測發現，BC-ECs中的miR205-3p表達水平相比HUCVE降低。這提示miR205-3p可能作為一個抑癌基因在BC-ECs的生物學功能中起重要的調控作用。

人MDM2基因位于12號染色體長臂12q[20]。其轉錄產物表達于人體的多種器官，其中骨骼肌含量最高，與細胞基本生理活動有關[21-22]。MDM2最重要的作用是抑制p53基因的激活轉錄功能和抗腫瘤活性，其編碼蛋白產物p90與p53蛋白結合，促進p53蛋白的降解，從而抑制腫瘤的增殖能力[23]。本研究通過生物信息學分析發現，miR205-3p可能與MDM2基因的mRNA 3'UTR區特異性結合。筆者通過熒光素酶報告基因實驗證實了miR205-3p與MDM2 mRNA 3'UTR具有互補結合位點，并結合Western blot實驗表明當提高miR205-3p的表達水平后，MDM2蛋白的表達受到抑制。為了進一步驗證miR205-3p通過靶向調控MDM2參與腫瘤血管內皮細胞增殖的調控，在體外實驗中，把miR205-3p mimics轉染BC-ECs后，其增殖受到抑制。體內實驗中，把miR205-3p agomir通過尾靜脈注射到小鼠體內后，乳腺癌皮下瘤組織生長速度降低。以上結果提示，miR205-3p通過調控MDM2表達來抑制BC-ECs的增殖，間接抑制乳腺癌組織的生長。

綜上所述，miR205-3p在BC-ECs中呈低表達，上調miR205-3p靶向MDM2蛋白表達降低，可抑制BCECs的增殖。因此，miR205-3p有望成為抗乳腺癌血管治療的潛在靶點。