冠突散囊菌發酵液對免疫抑制小鼠免疫學指標的影響

彭 穎

(長沙商貿旅游職業技術學院，湖南 長沙 410016)

冠突散囊菌又名金花菌，是傳統茯磚茶通過獨特的“發花”工藝長成的黃色真菌[1]。冠突散囊菌不僅能改善茯磚茶的色、香、味，還能使其具備降膽固醇[2]、抗氧化[3-4]及降血糖[5]作用，并能提高α-淀粉酶、蛋白酶活力[6]，抑制脂肪酶活力[7]。李佳蓮等[8]研究發現，茯磚茶浸提液和冠突散囊菌的發酵液均有明顯的抑菌作用；Wang等[9]證實用茯磚茶水提物灌胃被大腸桿菌感染的小鼠，能激活小鼠的免疫功能。

環磷酰胺作為一種廣譜抗腫瘤藥物，雖然療效顯著，但卻同時損傷正常細胞，導致機體出現免疫抑制和骨髓抑制，使得其在醫學治療上的應用受到限制[10]。中國自古就有將具有藥效作用的茯苓、冬蟲夏草、靈芝等真菌作為食物輔料，摻入人們的日常飲食中以達到強身健體的目的。近年來也有研究者將傳統藥食同源的中藥如天麻[11]、穿心蓮[12]、黃芪[13]、茯苓[14]、車前草[15]、馬齒莧[16]等與環磷酰胺結合使用，這些中藥均能降低環磷酰胺的毒副作用。但未見冠突散囊菌對經環磷酰胺干預的小鼠機體免疫功能影響的相關報道。研究擬用環磷酰胺干預昆明小鼠，建立免疫抑制模型，再用冠突散囊菌發酵液灌胃治療小鼠，考察冠突散囊菌發酵液對模型小鼠免疫指標的影響，以期為茯磚茶的保健作用研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茯磚茶：金湘益牌茯磚茶(2009年)，湖南益陽茶廠；

環磷酰胺：批號Q1547，上海躍騰生物技術有限公司；

雄性昆明小白鼠：體重(20±1) g，湖南斯萊克景達試驗動物有限公司；

鼠顆粒飼料：湖南斯萊克景達試驗動物有限公司；

IL-2 Elisa試劑盒：上海通蔚生物科技有限公司；

綿羊紅細胞、豚鼠血清：北京博爾西科技有限公司；

印度墨汁：上海信帆科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

霉菌培養箱：MJ-150(F)-I型，上海一恒科技有限公司；

可見分光光度計：7230G型，上海佑科儀器儀表有限公司；

全自動五分類血液細胞分析儀：BC-6000型，深圳開立生物醫療科技股份有限公司；

酶標儀：WD-2103A型，杭州匯爾儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 冠突散囊菌的分離純化 根據文獻[17]方法，并稍作修改。取25 g茯磚茶置于225 mL滅菌生理鹽水中，振蕩5 min，得到1∶10的樣品液。采用稀釋涂布法，將樣品稀釋液涂布于察氏培養基平板上，28 ℃培養5～7 d。采用平板劃線法進行優勢菌的分離純化，再挑取單菌落接種于斜面上，恒溫培養(28 ℃)，繼代3～4次后，獲得純化菌株，4 ℃保存備用。

1.3.2 冠突散囊菌發酵液的制備 將冠突散囊菌接入M40Y液體培養基，恒溫搖床培養10 d，溫度28 ℃，轉速150 r/min。培養結束后，發酵液放入組織破碎機中進行勻漿處理，即得質量濃度為21.2 mg/mL冠突散囊菌發酵液原液。將原液(21.2 mg/mL)用無菌蒸餾水分別稀釋2倍和4倍，得到冠突散囊菌中劑量組發酵液(10.6 mg/mL)和低劑量組發酵液(5.3 mg/mL)，4 ℃冰箱貯藏備用。

1.3.3 動物造模與分組 將小鼠置于溫度20～25 ℃，濕度40%～70%的實驗室中飼養，待小鼠適應環境后方可開展試驗。取30只昆明小鼠編號稱重，隨機分成5組每組6只，分別是正常組、對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。飼養前3 d，分別給各組小鼠(除正常組外)腹腔注射劑量為80 mg/kg的環磷酰胺0.2 mL，建立低免疫力模型。正常組小鼠則腹腔注射0.2 mL生理鹽水作為空白對照。第4～18天，低、中、高劑量組小鼠分別灌胃0.4 mL相應溶液，對照組和正常組則灌胃等體積無菌蒸餾水，每天一次，試驗期間各組小鼠自由飲水和采食。

1.3.4 脾臟指數測定 在最后一次給藥24 h，小鼠經稱重后，頸椎脫臼處死小鼠，立即解剖并摘取完整的脾臟組織。濾紙吸干脾臟表面的血污，稱量脾臟組織重量，按式(1)計算脾臟指數。

(1)

式中：

Si——脾臟指數，mg/g；

m1——脾臟重量，mg；

m2——體重，g。

1.3.5 單核—巨噬細胞吞噬指數的測定 每組6只小鼠末次灌胃24 h后，從尾靜脈注入用生理鹽水稀釋3倍的印度墨汁，劑量0.1 mL/10 g。分別于注入墨汁后的第2 min和第10 min，取20 μL內眥靜脈血至2 mL 0.1% Na2CO3溶液中。使用分光光度計在600 nm下測量光密度值，用Na2CO3溶液作為空白對照。按式(2)和式(3)計算廓清指數和吞噬系數：

(2)

式中：

K——廓清指數；

D600 nm，2 min——注射后2 min所取血樣光密度；

D600 nm，10 min——注射后10 min所取血樣光密度；

Δt——兩次取血樣的時間差，min。

(3)

式中：

α——吞噬系數；

m1——脾臟重量，g；

m2——體重，g；

m3——肝臟重量，g；

K——廓清指數。

1.3.6 半數溶血值的測定 用無菌生理鹽水配制體積分數為2%的綿羊紅細胞溶液，現配現用。末次灌胃1 h后，各組小鼠分別腹腔注射2%的綿羊紅細胞0.2 mL，并繼續正常飼養4 d。然后摘取眼球血1 mL于EP管內，室溫放置1 h后，低速離心(2 000 r/min，10 mim)以采集血清。用生理鹽水稀釋血清200倍，取1 mL血清稀釋液置于試管內。依次加入體積分數10%的綿羊紅細胞溶液0.5 mL，補體1 mL。另設對照組，用生理鹽水代替血清。各組均放入恒溫水浴鍋(37 ℃)溫育10 min后，放入冰浴終止反應。低速離心并取1 mL上清加入體積分數10%的綿羊紅細胞溶液0.25 mL，然后滴加都氏試劑(碳酸氫鈉1.0 g，高鐵氰化鉀0.2 g，氰化鉀0.05 g，加蒸餾水至1 000 mL)至4 mL，充分混勻后靜置10 min。在450 nm處，以對照管作空白，分別測定各管光密度值。

(4)

式中：

Hhv——半數溶血值；

D450 nm，1——樣本光密度值；

D450 nm，2——SRBC半溶血時的光密度值；

d——稀釋倍數。

1.3.7 遲發型變態反應(DTH)檢測 足趾增厚法。用0.2 mL體積分數2%的綿羊紅細胞溶液腹腔注射各組小鼠，使小鼠致敏。4 d后，用游標卡尺測量左后足足趾部厚度，每個樣本在同一位置測量3次并取平均值。在測量部位皮下注射體積分數20%的綿羊紅細胞溶液20 μL，并在24 h后測量3次小鼠的左后足足趾部厚度，計算3次平均值。DTH的水平用兩次測量值的平均厚度差表示。

1.3.8 血清中白介素-2(IL-2)質量濃度的檢測 最后一次灌胃24 h后，各組小鼠用1.5 mL離心管收集眼球血，37 ℃溫箱30 min，使血清充分析出，冷凍離心(3 000 r/min)10 min。收集上層血清，用ELISA法[18]檢測IL-2的質量濃度。

1.4 數據處理

試驗結果用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，數據以平均值±標準差表示。通過Dunken的分析方法進行統計學檢驗，P<0.05認為具有統計學差異，并以不同小寫字母進行標記。

2 結果與分析

2.1 各組小鼠的臨床表現

正常組小鼠，表現好動，抓尾反抗力強，毛色正常順滑，無明顯可見的臨床癥狀。造模期間，經腹腔注射環磷酰胺后的小鼠，表現較為平靜，活動減少，抓尾反抗力減弱，毛發稀疏蓬松，有比較嚴重的掉毛現象。用冠突散囊菌發酵液灌胃治療后，小鼠的活動強度、抓尾反抗力及毛發狀態均有所好轉，而且部分小鼠基本恢復正常。

2.2 冠突散囊菌發酵液對小鼠脾臟指數的影響

由圖1可知，與正常組相比，對照組脾臟指數顯著上升。經不同劑量的冠突散囊菌發酵液治療后，中劑量組小鼠的脾臟指數呈上升趨勢，而低劑量組和高劑量組小鼠的脾臟指數與對照組無顯著差異，仍明顯高于正常組(P<0.05)。

圖1 冠突散囊菌發酵液對小鼠脾臟指數的影響

Zhang等[19]證實環磷酰胺對小鼠具有生物學毒性，尤其對免疫功能造成很大刺激，能顯著降低小鼠的脾臟指數。而試驗中僅用環磷酰胺刺激小鼠3 d，便停止了刺激，造成小鼠的脾臟指數在檢測時呈現出免疫抵抗而上升的現象，可能是在冠突散囊菌發酵液的作用下，機體產生了免疫抑制抵抗，因而脾臟指數有上升的趨勢。這與顏愛等[20]報道的短時間環磷酰胺刺激使脾臟出現“反彈”的現象一致。而小鼠在冠突散囊菌發酵液的治療下，各劑量組均能達到提高脾臟指數的目的，且各劑量組的功效差異并不顯著。

2.3 冠突散囊菌發酵液對小鼠單核—巨噬細胞吞噬指數的影響

由圖2可知，對照組小鼠的單核—巨噬細胞吞噬指數顯著低于正常組(P<0.01)，說明環磷酰胺能抑制小鼠的單核—巨噬細胞吞噬能力，但經不同劑量的冠突散囊菌發酵液治療后，仍無顯著變化(P>0.05)，提示冠突散囊菌發酵液可能對單核—巨噬細胞的吞噬能力無明顯作用，可能是冠突散囊菌發酵液成分較復雜，對巨噬細胞吞噬能力整體影響不大。

圖2 冠突散囊菌發酵液對小鼠單核—巨噬細胞

2.4 冠突散囊菌發酵液對小鼠半數溶血值(HC50)的影響

由圖3可知，腹腔注射環磷酰胺后，小鼠的HC50顯著低于正常組，說明在環磷酰胺的刺激下，B淋巴細胞分泌抗體的能力降低。但經不同劑量的冠突散囊菌發酵液治療后，小鼠的HC50呈劑量依賴性上升趨勢，且各治療組均顯著高于對照組(P<0.05)，其中中、高劑量組小鼠的HC50分別是對照組的1.26，1.33倍，而且與正常組無明顯差異。說明冠突散囊菌發酵液有助于B淋巴細胞產生抗體，增強體液免疫。

圖3 冠突散囊菌發酵液對小鼠半數溶血值的影響

2.5 冠突散囊菌發酵液對小鼠遲發型變態反應(DTH)的影響

由圖4可知，經腹腔注射環磷酰胺的小鼠，其足趾厚度差顯著低于正常組，表明環磷酰胺顯著抑制正常小鼠的遲發型變態反應(P<0.05)。與對照組相比，各劑量組小鼠DTH呈量效性上升，且均具有統計學意義，其中中、高劑量組小鼠的DTH與正常組差異并不顯著，提示冠突散囊菌各劑量均能消除環磷酰胺的抑制作用，且能在動態調節中促進小鼠的遲發型變態反應，使小鼠的細胞免疫恢復正常值。這與劉龍龍等[21]發現的藍莓酸性提取物在正常范圍內能提高小鼠的脾臟指數和遲發性變態反應的結果類似。說明冠突散囊菌發酵液具有增強小鼠自身細胞免疫的功能。

圖4 冠突散囊菌發酵液對小鼠遲發型變態反應的影響

2.6 冠突散囊菌發酵液對小鼠血清中IL-2質量濃度的影響

IL-2主要由T細胞產生，在機體免疫功能中發揮著重要作用。IL-2 能刺激T細胞生長，增強單核—巨噬細胞的抗原遞呈能力、殺菌能力、細胞毒性作用；直接作用于B細胞，促進B細胞的增值、分化和抗體分泌；激發自然殺傷細胞和毒性T細胞的殺傷力。由圖5可知，對照組小鼠血清中IL-2的質量濃度與正常組相比有所下降，但并未達到顯著性水平。而低、中、高劑量組小鼠血清中IL-2的質量濃度顯著高于對照組(P<0.05)，分別為正常組的3.07，3.10，2.87倍。IL-2的高表達能刺激機體免疫細胞的增值、分化和抗體的分泌，因此，冠突散囊菌發酵液刺激T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2來增強免疫低下小鼠的免疫功能。

圖5 冠突散囊菌發酵液對小鼠血清中IL-2質量濃度的影響

3 結論

試驗從茯磚茶中分離純化冠突散囊菌，考察了冠突散囊菌發酵液對免疫抑制小鼠免疫指標的影響。結果表明，冠突散囊菌發酵液可通過促進B細胞產生抗體，激活T淋巴細胞功能，刺激T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2來增強小鼠免疫功能。但由于冠突散囊菌發酵液的成分暫不清晰，菌體成分或代謝產物等還需進一步分離純化，后續將繼續探究發酵液中代謝產物、多糖等具體成分的作用，以更全面、更深層次地揭示茯磚茶生理功能背后的作用機理。