植物單寧分離提純及功能活性研究進展

黃達榮 張雅甄 鄭百濤 杜 冰 黎 攀

(華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642)

植物單寧是一種天然多酚類化合物，多存在于陸地與海洋的大部分植物之中。其可以與唾液蛋白質結合，也可以聯合動物膠原多肽鏈從而增強皮的韌性，前者是澀味的來源，后者是鞣革的原理，因此單寧也被稱作“鞣質”。單寧作為植物的次生代謝產物，是豐富度僅次于纖維素、半纖維素和木質素的生物質資源[1]，主要分布在植物的根[2]、莖[3]、葉[4]及皮[2-3]中，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等活性[5-7]，被廣泛應用于食品、醫藥及制革[8]等領域。目前，常用的單寧提取方法主要為浸提法與萃取法，并輔以超聲波、微波、加壓等[9]，而提取液多為甲醇、乙醇與丙酮等有機溶劑[10]，但不同植物來源的單寧需要優化其提取與純化工藝。

文章擬綜述單寧的分類與應用，以及近年來植物單寧的提取與純化方法的發展現狀，并提供一個通用于大部分植物單寧提取與純化的方法，同時歸納單寧功能活性及其機制，以期為單寧的高效獲取與高值化應用提供依據。

1 植物單寧的分類及應用

1.1 植物單寧的分類

植物單寧可根據化學結構、來源品種和化學特性進行分類，目前普遍按照單寧的結構差異將其分為水解單寧和縮合單寧兩大類(見圖1)，其相對分子量約為500～20 000 Da。此外，還有復合單寧和褐藻單寧，但兩者罕見于陸生植物中，復合單寧由黃烷-3-醇與水解單寧結合而成，褐藻單寧是間苯三酚的聚合產物，可占海藻干重的30%，其已被證明具有抗菌、抗氧化等活性[11]。植物單寧的常見類型可由表1的方法[12]進行鑒別。

圖1 水解單寧與縮合單寧的典型結構

表1 水解單寧與縮合單寧的鑒別反應

水解單寧即可水解的單寧，是一種以多元醇為中心，如葡萄糖，通過酯鍵連接數個酚酸及其衍生物的化合物[13]，其中多元酚酸是決定單寧性質的關鍵部分。水解單寧遇酸、堿或酶時容易水解生成小分子量的化合物，根據水解生成的多元酚羧酸不同，將水解單寧分為鞣花酸單寧和沒食子酸單寧。此外，沒食子酸衍生物也是水解單寧的一類，其一般含有6個及以上的沒食子酰基單元。

縮合單寧又稱原花色素，以不含糖核的類黃酮、黃烷-3-醇(見圖2)作為結構單元聚合而成，其A環可出現間苯二酚或間苯三酚形式，而B環可出現鄰苯二酚或鄰苯三酚形式[14]，構成了不同的縮合單寧結構單元[15]；分子間以碳碳鍵相連且不含糖基，不易被水解；與水解單寧相比，縮合單寧的分子量范圍較廣，可以在酸、堿或酶作用下發生縮合反應，而進一步的縮聚會產生不溶于水的紅粉[12]，但高相對分子質量的縮合單寧的分子體積大，在空間中移動時受到的阻力大，導致其生物活性較低。

圖2 黃烷-3-醇的結構

1.2 植物單寧的應用

單寧不僅可以作為調味劑在茶、咖啡等飲料中調節風味，用于生產速溶飲料，還能影響食品色澤，其機理是單寧在環境中容易被氧化為醌類物質而加深顏色。此外利用單寧與蛋白結合的性質，將牛血清蛋白與單寧酸制成多層微膠囊，可延緩胃酸的侵蝕，有效保護膠囊中的乳鐵蛋白，并制備多層微膠囊的乳鐵蛋白口服制劑[16]，而固定化單寧可在食品加工領域中純化活性肽與蛋白質、澄清酒與飲料[17]；單寧還可以抑制食品腐敗菌而延長食品保藏期[18]。此外，單寧在制革[19]、醫藥[20]與水處理[21]等領域也發揮著重要作用。

2 植物單寧提取與純化

2.1 提取方法

單寧的含量測定[22]見表2。目前，單寧的定量分析方法有高效液相色譜法、液質聯用法等，這些方法較多應用于總酚含量的測定，盡管有測定縮合單寧的方法，但幾乎沒有一種可以普適于各種植物單寧定量的方法，因為定量時常用的如沒食子酸、兒茶素、表兒茶素等標準品，與各種植物單寧組分差異較大，其標準品選擇仍是一個尚未解決的問題。因此目前定量植物單寧一般參考前人文獻的方法，或者對多種測定方法進行內標法等方法學篩查，確定含量后再經高效液相色譜分離可以明確植物單寧組分。

表2 單寧的定量方法

2.1.1 溶劑浸提法 溶劑提取法是提取單寧的基礎方法，可以分為無機溶劑法和有機溶劑法，如水和甲醇、乙醇、丙酮等。其中熱水提取是中國最傳統的方法，雖然單寧溶于水、乙醇與丙酮，但植物中也含有水溶性的樹脂、蛋白質、淀粉等雜質，直接用水提取所得到的植物單寧含量較低，水與有機溶劑混合后進行提取成為主流，如水—丙酮體系能破壞單寧與蛋白質的連接鍵，提高單寧提取率[23]。為了更高效地提取單寧，在確定提取溶劑的基礎上，輔以超聲波、微波、加熱等方法(見表3)，并利用正交試驗與響應面試驗進行單寧提取工藝優化。

2.1.2 超聲波、微波提取和酶解轉化法 單寧是植物細胞產物，細胞膜和細胞壁是單寧提取的主要阻礙。超聲波具有機械效應、空化效應及熱效應，微波則使胞內水分吸收微波能而汽化，對細胞膜和細胞壁產生壓力而形成小孔，酶能選擇性地分解細胞膜與細胞壁，且條件更為溫和，因此酶輔助提取已被廣泛用于從食品和植物中提取不同種類的化合物[34]。三者一般用于輔助溶劑對植物單寧進行提取。

表3 不同植物單寧的提取方法?

2.1.3 超臨界流體萃取法 超臨界流體具有液體和氣體的雙重性質，通過控制壓力和溫度即能選擇性地萃取出植物單寧，二氧化碳因其清潔、成本低、萃取時性質穩定等特點，目前被用作超臨界流體，且利用超臨界二氧化碳萃取可以保護單寧免受氧化。姜萍等[35]應用超臨界二氧化碳提取五倍子中的單寧酸，經條件優化后得率高達57.83%，但目前國內外較少應用該技術提取單寧，可能是萃取所用儀器要求高，成本也較高。

2.2 純化方法

2.2.1 溶劑萃取及沉淀吸附法 單寧在醇類、丙酮等有機溶劑中溶解度較高，而高濃度乙醇能沉淀植物的大部分蛋白質，因此有機溶劑均能在提取與純化單寧時發揮作用，但利用溶劑萃取仍處于初步純化階段且溶劑殘留會影響產品質量。此外，還可以利用疏松多孔的活性炭或皮粉吸附大量雜質，其中包括植物色素、樹膠等。

2.2.2 色譜分離法 目前制備高純度單寧及有關化合物的主要方法是色譜分離法。固定相一般選用大孔樹脂和葡聚糖凝膠，前者的耐壓性較強，裝柱后能承載較高流速而不塌陷，純化效率比后者高，而后者以Sephadex LH-20為主。范小曼[36]聯合運用XAD16HP大孔樹脂與葡聚糖凝膠LH-20提純了白花敗醬單寧，并對單寧組分進行了有效分離。在對不同植物單寧進行純化時，需先篩選合適的固定相，后進行靜態與動態的解吸、吸附試驗，以確定層析柱的上樣濃度、上樣流速、洗脫劑類型及濃度等參數。

2.2.3 膜分離 膜技術以選擇透過性的膜為基礎，如微濾、納濾和超濾膜，為新興的綠色技術，但近年來鮮有報道，可能是因為大部分植物的單寧含量較低，提取時需要除去大量雜質，易導致膜堵塞。杜運平等[37]采用聚砜中空纖維膜分離了板栗苞單寧，純度約為64.00%。

3 植物單寧的功能活性及機制

3.1 抗氧化

單寧的抗氧化性體現在4個方面：① 作為氫供體通過還原反應降低環境中的活性氧、自由基等；② 螯合金屬離子，避免催化過氧化物進一步氧化；③ 調控機體中的氧化還原系統[38]，還原型谷胱甘肽可以上調Bcl-2與Bax的比值，清除機體內自由基，而叢明等[39]研究發現，用原花青素灌胃大鼠，能顯著增加大鼠大腦皮質的Bcl-2/Bax值，調控集體氧化系統；④ 調控機體與氧化應激的相關信號通路，緩解應激狀態下的損傷，目前主要調控的信號通路為Keap1-Nrf2/ARE，而杏仁皮中的縮合單寧能激活該通路[40]，提高機體抗氧化蛋白的表達量。單寧的抗氧化活性是觸發抗炎等有益機制的基礎，其可能涉及的機制如圖3所示，但具體的作用機制仍需更深入的研究，特別是考慮到不同植物的單寧的給藥劑量及其代謝圖譜的多樣性。此外，單寧還能與腸道相互作用，黃烷-3-醇單體能被腸道吸收[41]，但其聚合體能被腸道菌群降解吸收或與腸道蛋白結合而增強腸道屏障。

圖3 單寧的抗氧化特性可能涉及的機制[11]

3.2 抑菌

單寧對致齲細菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌[42]具有顯著的抑制效果，還可以促進牙體組織礦化、治療牙周及牙體牙髓疾病，因此被廣泛應用于口腔醫學領域。單寧對細菌抑制的重要結構是酚羥基，而單寧抑菌的機制主要分為：① 螯合細菌所需的金屬離子，如鐵和銅；② 抑制并破壞細胞壁和細胞內外膜的形成，減少病菌的粘附；③ 與細菌特定靶標蛋白和藥物外排蛋白結合，提高藥物對細菌的殺傷力；④ 抑制細菌代謝所需的酶[43]，影響細菌的蛋白質合成、能量代謝和氧化還原系統；⑤ 增強機體免疫力，如草莓單寧可以抑制NF-κB信號通路，降低人體炎癥因子的水平[44]。

3.3 抗病毒

植物單寧對冠狀病毒[45]和諾如病毒[46]有顯著抑制能力，后者利用NoV P蛋白開發了一種以唾液為基礎的結合—阻斷試驗，并以此來評價50種植物單寧抑制諾如病毒的能力，從而篩選出石榴單寧與五倍子單寧作為抗諾如病毒的潛在候選藥物，這提示需要建立植物單寧的標準化藥效評價體系。單寧抗病毒的機制與抑菌類似，會抑制病毒的酶與生物膜，阻止病毒侵入細胞和細胞核，抑制病毒反轉錄和復制，此外單寧還會削弱病毒粘附細胞的能力、運動能力[47]，同時單寧促使病毒蛋白質變性、阻斷病毒的胞間傳播來實現抗病毒的功能，但不同來源和化學結構的植物單寧抗病毒性能也有所差異，因此需進一步探索其具體抗病毒機制和動物試驗。

3.4 抗腫瘤

單寧可以通過抑制端粒酶活性、激活內質網應激介導的UPR信號通路誘導腫瘤細胞凋亡。其中腫瘤細胞內ROS含量是調控細胞生長的關鍵，一方面ROS能加快腫瘤細胞繁殖分化、激活轉移相關的信號通路，而另一方面高濃度的ROS含量能誘導腫瘤細胞凋亡；單寧酸能提高腎癌細胞中ROS含量、降低黏附分子ICAM-1的表達量，促進腎癌細胞的凋亡并抑制細胞集聚與轉移。同時抗炎、抗氧化的機制也對抑制腫瘤細胞具有積極影響。已有研究[48]證明植物單寧對結腸直腸癌、胰腺癌細胞的抑制作用，但多數研究僅聚焦于細胞模型的評價，這與動物模型具有較大差異，細胞模型的積極作用不能等同于動物試驗的藥效，因此需要建立小鼠或大鼠的腫瘤模型進行藥效試驗。

3.5 調節血糖

單寧降低血糖的作用已在脂肪細胞、大小鼠、幼豬、魚類為對象的試驗中得到了證實[49-50]。其血糖調節機制可分為：① 抑制α-葡萄糖苷酶等食物分解酶的活性，影響機體吸收；② 促進胰島β細胞再生和胰島素的分泌；③ 促進糖酵解，抑制糖異生；④ 作用于腸道菌群而調節血糖[50]。單寧對2型糖尿病的癥狀有改善作用[51]，但血糖調節的分子機制仍是單寧降血糖的研究點，單寧對糖酵解、糖異生途徑的影響研究不足，尤其是胰島素與糖代謝的信號通路具有較大的研究潛力。

3.6 抗炎

Aguiar等[52]報道原花青素能通過抑制新陳代謝和炎癥遞質而起到積極的抗炎作用；Pallarès等[53]發現葡萄籽的原花青素可以降低營養型肥胖大鼠模型的慢性低度炎癥。綜上，單寧的抗炎能力可能是調節細胞炎癥因子水平如下調肝臟組織中的TNF-α與IL-6水平、抑制NO與前列腺素E-2等致炎物質的產生、防止致炎物質與其他分子絡合，更具體的抗炎機制還有待探索，但單寧的抗炎活性已被證明，且單寧的抗炎能力與其抗氧化和抗菌等能力相關，因為致病菌和超氧化物與炎癥具有密切聯系。

3.7 抑制寄生蟲

植物及其提取物已被用作人類和家畜的驅蟲劑。從水解單寧的角度來看，其干擾蟲卵孵化和幼蟲運動的3種機制[54]為：① 擁有強蛋白沉淀能力的水解單寧與卵和幼蟲通過非共價鍵結合；② 具有高氧化活性的水解單寧可能被自身氧化，并且氧化產物與卵和幼蟲共價結合；③ 水解單寧進行水解，并且水解產物可能通過非共價或共價相互作用與卵和幼蟲相互作用，從而破壞卵的發育及幼蟲運動，但縮合單寧的驅蟲機理與調控機制尚未明確，有待進一步研究。

4 小結與展望

目前單寧主要是從蟲癭五倍子中提取，但隨著單寧需求量的上升，不同植物的單寧開發逐漸受到關注，而植物單寧的自然資源豐富，具有廣闊的應用前景。單寧類化合物結構復雜，有關單一植物單寧的結構和營養特性研究還不夠充分，學科間的交叉研究較為欠缺，導致部分結論與作用機理不明確，在不同植物單寧的生物活性研究方面難以形成完整系統。

在單寧功能活性產品開發方面，其難點在于工作人員需擴大研究范圍，針對不同來源的植物單寧中起功效的活性成分、結構特點和發揮作用的機理進行探索，才能實現植物單寧在產品開發上的精準應用。但植物單寧的不同提取來源和添加濃度，以及不同動物種類和生理狀態會影響其添加效果。后續需對不同植物單寧的構效關系以及單寧的添加劑量進行標準化，建立不同藥效評價模型，并分析不同植物單寧的組分與結構，以明晰不同分子結構類型以及不同劑量單寧的作用機理，實現單寧在各個領域中的應用。