油菜蜂花粉破壁技術研究進展

鄭 慧 楊思琪 孫 艷 李順祥

(1. 湖南中醫藥大學藥學院食品藥品工程系，湖南 長沙 410208；2. 湖南省中藥活性物質篩選工程技術研究中心，湖南 長沙 410208)

中國是世界上認識和應用花粉最早的國家，在《神農本草經》《本草綱目》《唐本草》等古籍中就有花粉的應用記載。大多數的天然花粉人工采集較為困難，從花粉的資源和品種數量上考慮，蟲媒花粉是可開發性最好的花粉種類。

蜂花粉是蜜蜂從蜜粉源植物花蕊內采集的花粉粒與其自身腺體分泌物加工而成的一種混合物，富含蛋白質、維生素、酶、黃酮等活性成分，具有增強免疫力[1]、抗氧化[2-3]、抗炎癥、抗腫瘤、降血糖等功效，在食用、藥用、化妝品等方面具有獨特的研究價值和廣闊的應用前景[4-5]。將蜜蜂采集的不同蜜粉源植物的花粉加工成不同品種的蜂花粉，其活性成分有顯著差異，作用功效也有所不同，如油菜蜂花粉在前列腺疾病的治療方面具有獨特的療效[6]；茶花蜂花粉有較好的美容效果[7]；蕎麥蜂花粉具有預防心腦血管疾病的功效等[8]。但蜂花粉的細胞壁致密、堅硬，在一定程度上限制了蜂花粉的開發利用，是蜂花粉深加工產品研發中的一個技術壁壘[9]。

目前蜂花粉的破壁方法主要有物理破壁、化學破壁、生物破壁[10-12]以及復合破壁[13]。因不同品種的蜂花粉在細胞結構方面有顯著差異，故同一種破壁方法對不同品種蜂花粉的破壁效果不同[14-15]。目前已有一些關于蜂花粉破壁技術相關的綜述，但并沒有針對單個品種的，忽略了不同品種蜂花粉之間破壁技術的差異性。中國是主要的蜜粉源作物品種，目前中國油菜種植面積居世界首位，油菜蜂花粉的產量占全國蜂花粉總產量的60%以上[16]。同時油菜蜂花粉已被中國衛生部納入了“作為普通食品管理的食品新資源名單”，有較好的開發基礎，是中國開發利用最多的蜂花粉品種[17]。文章擬對油菜蜂花粉破壁技術進行綜述，以期為油菜蜂花粉的精深加工提供依據。

1 油菜蜂花粉的細胞結構及破壁形態

1.1 細胞結構

作為幾種常見的蜜粉源植物代表，油菜、蓮花、杏花、茶、五味子、蕎麥蜂花粉細胞在形態結構方面具有明顯的區別(圖1)，就花粉粒的形狀大小而言，蓮花的花粉粒最大，為(50～70) μm×(50～70) μm，呈圓球形，而其他5種花粉均呈長橢球形；就花粉外壁表面紋飾而言，6種花粉分別具有網狀、腦紋狀、細條紋狀、皺波狀—擬網狀、條紋狀、細網狀的外壁紋飾；就萌發溝數量而言，大多蜜源植物花粉具有3個萌發溝，但也有少數花粉不同，如芝麻花粉粒具有12條萌發溝等[18]。

油菜蜂花粉細胞自然狀態下呈橄欖球狀，粉粒大小為(30～40) μm×(20～25) μm[圖1(a)]，吸水后會變成圓球形狀。油菜蜂花粉的細胞壁分內壁和外壁[圖1(g)]，多由不易被消化的組分構成，內壁主要為纖維素、果膠和蛋白；外壁主要為孢粉素和纖維素。外壁的孢粉素是一種高分子氧化聚合物，抗高溫、高壓和耐酸堿腐蝕，使得蜂花粉外壁難以被分解，成為阻礙蜂花粉營養成分溶出的主要結構。油菜蜂花粉的壁上等距離分布3個萌發孔，萌發孔處只有內壁而缺少外壁，內壁似一層彈性膜，包裹著內容物[21-22]。內壁的組成成分相比外壁較容易被破解，故在某些條件下萌發孔可作為蜂花粉破壁的關鍵部位。

a. 油菜蜂花粉 b. 蓮花蜂花粉 c. 杏花蜂花粉 d. 茶花蜂花粉

1.2 油菜蜂花粉破壁形態

油菜蜂花粉破壁時，多有以下4種情況(圖2)：① 內、外壁均破裂；② 只有內壁裂解，內容物從萌發孔處溢出；③ 只有外壁破裂，內壁包裹的內容物團塊暴露出來；④ 內外壁均未破裂：內壁包裹著內容物，在萌發孔處外突或外吐；內容物以分子狀態通過萌發孔發生外滲，引起花粉細胞縮小。目前，一般采用光學顯微鏡、掃描電鏡及透射電鏡通過肉眼觀察油菜蜂花粉的破壁情況，并通過觀察計數計算蜂花粉的破壁率。

a、b、j為OM圖[23] c、e、f為SEM圖[20,24-25] d、g、h、i為TEM圖[24]

2 油菜蜂花粉的破壁方法

2.1 物理破壁法

2.1.1 機械破壁 機械破壁是利用設備產生的各種物理作用力，使得蜂花粉粒徑減小而實現破壁的方法，根據作用力的不同，又分為氣流式、磨介式和剪切式超微粉碎。

氣流式粉碎是借助高速氣流，使蜂花粉顆粒間或者顆粒與固定板間相互碰撞而達到超細粉碎目的。延莎等[26]研究表明氣流超微粉碎對油菜蜂花粉的破壁效果極好，電鏡下幾乎無完整花粉粒存在，且經該法破壁后，蜂花粉的抗氧化活性功能顯著增強。

磨介式粉碎是利用蜂花粉顆粒與研磨介質之間相對運動產生的擠壓力和剪切力而實現粉碎。球磨機、振動磨和攪拌磨是磨介式粉碎的典型設備。其中，球磨機主要靠筒體旋轉以及磨介的自重來實現對物料的粉碎。曲成[27]研究了球磨工藝中的鋼珠類型、研磨時間和固液比對油菜蜂花粉破壁的影響，在最佳條件下其破壁率可達92.5%。王林等[28]研究表明在油菜、茶花、荷花和玫瑰4種蜂花粉中，球磨破壁的油菜蜂花粉游離氨基酸含量最高。振動磨主要借助磨介的高頻振動來粉碎物料，與球磨機相比其粉碎粒徑更低，破壁率更高。

剪切式粉碎如高剪切乳化技術，是使蜂花粉細胞壁在來回多次受剪切機定子、轉子狹窄的間隙中的強烈剪切力、擠壓力、摩擦力和撞擊力等作用而破裂。李麗等[29-30]研究并確定了高剪切乳化技術破壁油菜蜂花粉的最佳工藝條件：破壁時間3 min、高剪機轉速22 000 r/min、液料比3∶1 (mL/g)，該條件下花粉破壁率達到99%以上，且油菜蜂花粉黃酮的提取量與破壁率呈正相關，破壁有利于油菜蜂花粉中黃酮的溶出。

2.1.2 溫差破壁 溫差破壁是利用低溫下蜂花粉細胞外壁發生脆化，且胞內水分形成的冰晶刺破花粉壁而實現破壁。對蜂花粉進行反復的低溫冷凍與高溫解凍，以提高破壁效果。依據冷凍與解凍方式的不同，分為常規溫差法、液氮淬冷法和微波法。

常規溫差法是指用冰箱冷凍與熱水解凍處理蜂花粉的破壁方法。劉威[31]研究發現冷凍溫度、冷凍時間、解凍溫度和加熱時間對不同蜂花粉的影響不同，其中解凍溫度對油菜蜂花粉破壁率的影響最為顯著。阮征等[32]比較了油菜蜂花粉的超聲法、酶法、溫差破壁法及復合法的破壁率，在試驗條件下溫差法破壁率超過76%，破壁效果優于超聲法和酶解法。同時，油菜蜂花粉經溫差破壁后，蛋白質、脂肪等主要營養素均略有提高[33]。

液氮淬冷法是利用液氮對油菜蜂花粉進行超低溫快速冷凍、解凍以達到破壁的效果。周順華等[34]研究了外包材料、解凍溫度和反復凍結解凍次數對液氮法破壁油菜蜂花粉的影響，在最佳破壁工藝下破壁率可達94.97%。

微波法在溫差破壁中主要應用在低溫處理后的微波解凍，蜂花粉顆粒吸收微波能使胞內溫度迅速升高而達到破壁的方法。黨云剛[35]探究了解凍時間、次數、溫度及微波功率對油菜蜂花粉微波破壁的影響，確定了在解凍溫度60 ℃，解凍時間8 min、微波功率540 W、微波處理4次下的破壁率為85.53%。

2.1.3 壓差破壁 壓差破壁是借助液體低壓汽化原理，蜂花粉經高壓處理再突然降壓，細胞間隙流體迅速汽化產生的巨大壓差，而使蜂花粉細胞破裂。包括超臨界CO2破壁法和蒸汽爆破破壁法。

超臨界CO2破壁是利用臨界流體的高滲透能力和對壓力的敏感性，使其在高壓條件下滲入蜂花粉細胞，再降壓后汽化，細胞內外產生較大壓差而脹破花粉細胞。因超臨界流體較好的溶解能力，在蜂花粉中超臨界CO2主要用于脂類物質的萃取[36]。研究[37-38]表明，壓力越高，破壁效果越好，45 MPa下蜂花粉細胞已被完全破壞，且破壁前后脂肪酸組成差異顯著。

蒸汽爆破法是將蜂花粉用蒸汽加熱并維持一定時間高壓，當高壓瞬時解除時，細胞孔隙中的過熱液體被迅速汽化，體積膨脹而破裂。倪輝等[39]研究表明蒸汽爆破技術在工藝放大試驗中蜂花粉的破壁率保持在41%左右。

2.1.4 脈沖電場破壁 脈沖電場破壁主要靠兩種作用使蜂花粉細胞發生破裂：① 通過脈沖放電在膜內外產生大的電勢差而引發電穿孔現象；② 高頻變化的電場在膜表面產生的振蕩效應。熊夏宇等[25]通過觀察脈沖電場處理后的油菜蜂花粉細胞形態變化，表明脈沖電場的破壁效果顯著。王滿生等[40]研究報道了經脈沖電場處理后油菜蜂花粉醇提物中槲皮素和山奈酚的含量有所提高。

2.1.5 超聲破壁 超聲破壁是利用超聲波空化作用產生的氣泡的強烈振蕩和氣泡崩潰產生的沖擊力，使花粉壁破裂、脫落。王林[28]采用超聲波對茶花、荷花、油菜花和玫瑰4種蜂花粉進行破壁處理，結果表明處理后油菜蜂花粉的粒徑最小，達8.39 μm，電鏡下其外壁完全被破碎打開；且與其他3種蜂花粉相比，油菜蜂花粉經破壁處理后總黃酮含量及增加率最高。Dong等[24]在超聲功率1 000 W、頻率80 kHz、48 ℃下對油菜蜂花粉進行破壁處理，電鏡觀察表明超聲波可將外壁破碎，對內壁作用效果不明顯。阮征等[32]研究對比了超聲處理與酶法、溫差法及復合破壁方法，發現單獨的超聲處理破壁效果不佳，破壁率不足53%。

2.2 化學破壁法

2.2.1 酸法破壁 酸法破壁是利用酸性溶劑調節蜂花粉水溶液的pH，改變蛋白質電荷性使其易于分解；同時，通過浸泡使花粉吸收足夠的水而發生內膜囊外突乃至外吐，從而實現花粉破壁。劉春纓[41]根據人體胃液成分及其pH模擬胃液的酸性環境進行了油菜蜂花粉破壁探究，研究不同的混合試劑在不同溫度、pH值、花粉固液比和時間下的破壁情況，在最佳的理論條件下破壁率可達95%。

2.2.2 堿法破壁 堿法破壁與酸法破壁原理相似，一方面通過使花粉吸收水而膨脹，出現外吐；另一方面是堿與細胞壁的某些成分發生水解與皂化反應，使細胞壁溶解而實現破壁。曲成[27]研究發現水浸泡預處理在堿法破壁工藝中至關重要，且堿溶液的堿性和使用量均與蜂花粉的破壁率呈正相關。

2.3 生物破壁法

2.3.1 發酵破壁 發酵破壁法是以蜂花粉為氮源制作培養基，利用微生物發酵過程產生的酶來水解蜂花粉的細胞壁，從而達到破壁的目的。有學者[42-43]通過測定破壁率及發酵過程中的酶活性，探究了酵母、靈芝、杏鮑菇和羊肚菌對油菜蜂花粉發酵破壁的機理，表明發酵破壁主要是果膠酶、蛋白酶和羧甲基纖維素酶作用的結果。Yan等[44]研究顯示相比于乳酸菌及兩菌種混合，酵母菌在改善蜂花粉營養特性方面更具優勢。馮慧等[45-46]證明了酵母發酵為油菜蜂花粉發酵法中最佳的破壁法，并確定最佳的發酵破壁條件為：干性酵母添加量1%、固液比1∶1 (g/mL)、發酵時間3 d、發酵溫度32 ℃。黨云剛[36]對油菜蜂花粉酵母發酵破壁工藝進行了優化，其破壁率達77.63%。同時，酸輔助催化發酵破壁可極大縮短發酵破壁時間[47]。

2.3.2 酶法破壁 酶法破壁通過向蜂花粉溶液中加入蛋白酶、纖維素酶以及果膠酶等一種或多種酶，酶解蜂花粉的外壁和內壁從而實現花粉破壁。Dong等[24]研究發現蛋白水解酶可降解油菜蜂花粉萌發孔處的內壁。王凱等[48]通過對蛋白分散指數、可溶性糖含量的測定及鏡檢、粒徑分析研究確定了果膠酶破壁的最佳條件：pH 3.5、溫度50 ℃。另有研究[49-50]以破壁率、總黃酮得率和多糖提取率為指標，表明纖維素酶對油菜蜂花粉破壁有較好的作用。

受酶的專一性影響，單種酶的破壁效果有一定限度。為了提高酶法破壁率，較多學者[51-53]研究了復合酶制劑對油菜蜂花粉的破壁影響，表明復合酶法破壁效果佳并且可有效保留蜂花粉的營養成分。研究[54-55]發現，固液比、溫度及pH值是油菜蜂花粉酶法破壁效率的主要影響因素。楊曉萍等[56]研究對比了復合酶法與發酵法、溫差法和機械法破壁，發現復合酶法的破壁率最高，達92.86%。

2.3.3 仿生破壁 仿生法是以成熟蜂糧作為引子發酵劑，配以適當比例的水和蜂蜜制得酶化劑，向蜂花粉中加入酶化劑，利用其中的微生物體系對蜂花粉進行發酵破壁[57]。阿依努爾·熱西提等[58]探究了發酵時間、發酵溫度和蜂蜜加入量對蜂糧種子發酵液破壁能力的影響，得出最佳制備條件為：發酵時間15 h、發酵溫度35 ℃、蜂蜜加入量3.0%，此條件下油菜蜂花粉完全破壁率為53.53%。

2.4 復合破壁法

單一使用上述幾種方法存在破壁率低、耗時、營養損失等缺點，為了實現油菜蜂花粉相對高效的破壁，可采用復合破壁方法。黨云剛[35]探究了油菜蜂花粉的溫差—超聲破壁工藝，最佳條件下的破壁率達88%以上，高于試驗條件下的其他方法。Dong等[24]通過掃描電鏡，發現蛋白酶—超聲復合法可降解油菜蜂花粉的外壁和內壁，外壁沿3個萌發孔裂解為3塊。任向楠[59]從粒度、鏡檢及可溶性糖含量等6個方面探究了超聲波輔助纖維素酶、蛋白酶破壁油菜蜂花粉，并對兩種復合破壁法進行了工藝優化。Wu等[20]證明了超聲波—高剪切破壁法可將油菜蜂花粉內、外壁徹底破碎，獲得較高的營養物提取率。有學者[15,60]采用超聲—高剪切法對蓮花、油菜、杏花、五味子及茶花5種蜂花粉進行破壁處理，并對比了破壁前后各種蜂花粉的營養及活性成分的變化，結果表明對比不同品種蜂花粉，同種營養因子的增加率不同，如甲硫氨酸、酪氨酸等的增加率最高的是油菜蜂花粉，總酚含量增加最高的是五味子蜂花粉，在油菜蜂花粉中的增加則相對較少。張紅成等[61]研究發現蛋白酶—超聲波—高剪切復合破壁方法具有簡單、穩定又高效的優勢。

3 油菜蜂花粉的營養和活性成分研究

研究[62]表明，油菜蜂花粉中的黃酮和酚酸具有強的自由基清除能力，是主要的抗氧化活性成分。多糖是油菜蜂花粉的抗腫瘤成分，主要通過提高白細胞介素2和腫瘤壞死因子mRNA的表達而發揮作用。脂肪酸在抗前列腺增生方面發揮主要作用[63]。氨基酸可作為皮膚角質層中的濕潤因子，可補充所需的膠原蛋白質，從而起到美膚的效果[64]。因此，對油菜蜂花粉的主要營養成分分析集中在蛋白質、糖和脂肪，功能成分主要集中在黃酮、酚酸、游離脂肪酸以及氨基酸。

對營養和活性成分的研究是實現油菜蜂花粉價值最大化的關鍵，同時也是促進油菜蜂花粉精深加工的推動力。因此在衡量蜂花粉破壁效果時，除了破壁率外，通常還要考慮破壁處理對營養及活性成分的影響。活性成分盡可能多地被保存，將有利于蜂花粉精深加工產品更好地發揮其功能作用，也大大節約了用于工業化生產的花粉資源。此外，油菜蜂花粉作為一種食品，破壁處理對其感官品質方面的影響也不容忽視。

4 破壁油菜蜂花粉的開發應用

研究表明，多種破壁方法可促進蜂花粉部分內含物的溶出，從而提高活性成分的作用效果[65-67]；此外，天然的花粉壁及壁外覆蓋物對花粉內容物有一定的保護作用，人為破壁后可能使得內容物暴露而不利于蜂花粉的保質和貯藏[68]。

目前破壁油菜蜂花粉已被廣泛應用于藥品有效成分提取、飲料制備、化妝品生產以及飼料加工中。油菜蜂花粉多被用于治療前列腺增生，在提取其有效成分如總甾醇和油菜花堿時，均對油菜蜂花粉進行了破壁處理[69-70]。馮瑛等[71]發明了一款油菜蜂花粉酒，采用了蜂花粉的破壁工藝對原料進行處理。還有學者[72]通過破壁獲得油菜蜂花粉提取物，并將其應用于抗衰老護膚品。油菜蜂花粉近年來在畜牧業中也被廣泛應用，將破壁的油菜蜂花粉添加至牲畜的飼料中，可有效提高牲畜的免疫力[73]。

5 總結與展望

近年來油菜蜂花粉的破壁相關研究很多,越來越多的新型技術也被運用于蜂花粉的破壁研究中。其中，物理破壁法是目前應用最多的一類破壁方法，大多操作簡便、耗時短，部分方法對設備有一定的要求；化學破壁法操作簡單，但化學試劑可能對產品造成污染，且酸、堿度過高也會影響產品的感官品質；相對而言，生物破壁法條件溫和，在某些條件下還能起到改善油菜蜂花粉特有的口感、提高感官品質，但一般耗時較長；復合破壁法一定程度上能綜合上述各種方法的優點，可以在最大限度保持油菜蜂花粉營養及活性成分的基礎上，獲得最高的破壁率。從加工角度看，破壁處理可有效提高油菜蜂花粉中活性成分的溶出率，利于油菜蜂花粉的深度開發利用。

油菜蜂花粉開發利用中的另一個技術壁壘是蜂花粉的致敏性。有研究[74]發現部分風媒花粉敏感者同樣表現出對蜂花粉及其提取物的敏感性。這主要與其中的酶、附著在花粉壁上的雜菌等有關，且蜂花粉外壁也可能存在致敏原[75]。因此，蜂花粉破壁的同時，也能破壞蜂花粉外壁的致敏源，降低蜂花粉的致敏性，將極大地推進蜂花粉產品的發展，這也將是油菜蜂花粉破壁技術的一個重要研究方向。