醬鹵肉制品中食品添加劑的固相提取與精確分析

王曉君 李鳳玲

(1. 煙臺理工學院食品與生物工程系，山東 煙臺 264005；2. 山東理工大學農業工程與食品科學學院，山東 淄博 255000)

食品添加劑在改善肉制品的色、香、味、形方面起著關鍵作用，對產品質量提升和降低生產成本也有一定的幫助，可以說食品添加劑有效地推動了肉類食品的高速發展[1-2]。根據國家食品安全標準規則，鹵制肉制品中常用的添加劑按照用途劃分有防腐劑、護色劑、抗氧化劑、著色劑、乳化劑等[3]。GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》對苯甲酸、山梨酸和糖精鈉在肉制品加工過程中的添加量有嚴格的限定。但不法商販為了延長產品的保存期限、保持肉制品的外觀與氣味，超量使用或違規使用添加劑的現象時有發生，嚴重危害消費者的利益及身心健康[4-6]。目前，GB 5009.28—2016《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》規定的測定方法有液相色譜法和氣相色譜法兩種。其中液相分析方法中對于高油脂試樣的處理，經正己烷脫脂后采用亞鐵氰化鉀沉淀劑沉淀蛋白，分離過程過于簡單，樣品中存在油脂殘留以及雜質的可能，無特異性吸附前處理，若直接使用C18柱，峰型特征無法保證。該方法各添加劑的保留時間較長，液相單針分析時間達到了18 min，分析效率不高，溶劑損耗大，且使用的沉淀劑亞鐵氰化鉀溶液易產生劇毒氰化物，后處理困難。由于肉制品含有大量的脂肪，傳統的靜置離心凈化方法很難將肉制品中的脂肪直接去掉，殘留的脂肪直接進樣容易污染色譜柱[7-8]。厲建軍等[9]曾用高效液相色譜分離肉制品中的添加劑，肉制品搗碎后需經超聲處理、亞鐵氰化鉀溶液沉淀、離心才能檢測，該方法的檢測限僅為0.001 8 g/kg，加標回收率為85%～101%，難以滿足日益增長的檢測精密度需求。而且高效液相色譜法在對營養豐富的肉制品中的苯甲酸、山梨酸等防腐劑和糖精鈉甜味劑進行檢驗時，常常會因保留時間的漂移和檢測精密度問題影響到檢測結果的判定[10]。盡管眾多的研究開展了對添加劑的檢測增加了不確定度分析，將主要原因歸集為樣品提取過程和儀器的精密度問題，擬通過加強操作人員的熟練度、規范試驗操作，減少人為因素對提取過程的影響和使用精密度更高的儀器從而提高檢測結果的準確性[11]。但人為的干預以及儀器的精密度無法解決復雜樣品的雜質干擾和分析條件的選擇性問題。研究擬選取特異性吸附的SPE-MCX固相萃取劑對成分復雜的醬鹵制肉樣品進行處理，結合HPLC法對添加劑進行定量分析并進行方法學驗證，以期為醬鹵制肉品中食品添加劑的檢測提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫高效液相色譜：LC-1260Ⅱ型，美國安捷倫公司；

液相色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18型，美國安捷倫公司；

可變速高速旋轉粉碎機：PULVERISETTE 14型，北京飛馳科學儀器有限公司；

超聲波清洗機：BKE-1004HT型，杭州博可超聲波設備有限公司；

電子分析天平：BL610型，瑞士梅特勒公司；

高速冷凍離心機：TJ-140型，美國THERMO公司；

高真空旋轉蒸發儀：R-300型，瑞士BUCHI公司；

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標準品：純度>98%，國家標準物中心；

正己烷、乙腈：色譜純，德國默克公司；

甲醇、甲酸：分析純，麥克林試劑公司；

1.2 磨損顆粒的制備 將真空球磨儀 （GN-Z高能球磨儀，沈陽市新科儀器機電設備廠）所有的組件按照ASTM F1903標準進行清洗，然后置于75%的酒精中浸泡，高溫滅菌以備用。將磨塊置入球磨罐中，加入100ml無水乙醇作為保護液，抽真空，開始球磨，每2h需要停機15min，以避免球磨罐溫度過高發熱。用400目篩網過濾乙醇和磨損顆粒，等待乙醇完全揮發后收集顆粒，本研究將球磨了12h、24h、48h、60h、72h 后獲得的顆粒分別進行收集[9]。

SPE-MCX、SPE.WCX、SPE.SIL固相萃取劑：山東博納生物集團；

五香脫骨鹵豬蹄：購于重慶、本溪、青島三地某食品公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 樣品前處理 切取5.0 g鹵肉樣品，加入5.0 g蒸餾水，置于粉碎機中，搗碎5 min形成肉泥，將破碎后的鹵肉液體加5.0 mL乙酸乙酯，置于超聲波清洗器中超聲10 min，再8 000 r/min離心10 min，取5.0 mL上清液，置于50.0 mL容量瓶中用甲醇定容，并用冰醋酸調pH至3.5～4.0，搖勻。依次流加5.0 mL乙醇和5.0 mL超純水在固相萃取柱中進行充分活化。然后移取5.0 mL上清液過柱，先用5.0 mL純化水洗雜，再用70%甲醇溶液5.0 mL洗脫，速度均為1 BV/h，洗脫液收集于容量瓶中。經過0.45 μm有機濾膜過濾后，收集待檢[12]。

1.2.2 標準溶液配制 分別稱取各標準品適量，用純化水超聲10 min，充分溶解；置于100 mL棕色容量瓶中，配成濃度為100 mg/L標準品母液，備用。使用時，3種物質的母液分別取0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL，各加入1 mL冰醋酸酸化并用高純水定容至100 mL，制得相應濃度的標準溶液，用錫箔紙包裹，于4 ℃避光保存。

1.3 液相條件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫25 ℃；流速0.8 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長230 nm；流動相A為0.02 mol/L乙酸銨水溶液，B為乙腈，VA∶VB=75∶25；光譜全波長掃描范圍210～400 nm。

1.4 試驗設計

1.4.1 固相萃取優化 分別選取固相萃取劑包括強陽離子交換的SPE-MCX、弱陽離子交換的SPE.WCX和中強度離子交換的SPE.SIL對樣品進行選擇性吸附，選取最佳的固相萃取劑。然后配置濃度為5 g/L各待測成分標準溶液，分別用冰醋酸調整pH至2.0，3.5，7.0，進料速度為1 BV/h，通過分析各物質出料濃度與進料濃度的比值，考察pH的變化對苯甲酸、山梨酸、糖精鈉在SPE-MCX固相萃取柱吸附效率的影響。在確定最佳的進料pH后，分別取5 mL含50 mg/L的苯甲酸、山梨酸和糖精鈉上樣，進料速度為1 BV/h，然后分別用5 mL純水、含30%，60%，90%甲醇溶液各5 mL來洗脫，分別收集并測定洗脫液中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉含量，然后計算各組分的回收率。

1.4.2 專屬性與保留時間優化 分別配制0.1 g/L苯甲酸、山梨酸和糖精鈉溶液，使用DAD檢測器在210～400 nm紫外全波長掃描，確定最佳的檢測波長。在該吸收波長下，分別試驗了3種食品添加劑在不同比例乙酸銨—乙腈溶液時的分離效果，流動相V乙酸銨∶V乙腈分別為90∶10，80∶20，72∶25，50∶50下的各物質保留時間。

1.4.3 方法學確認

(1) 線性范圍與檢測限：通過配置不同質量濃度的0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mg/L標準溶液進樣得到的標準曲線來評估方法的線性范圍及其相關性。以信噪比S/N=3計算檢出限。

(2) 回收率與精密度：為了滿足不同濃度下3種添加劑的檢測的需求，分別在0.05，0.50，1.00 mg/kg 3個水平下進行加標回收試驗。

2 結果與討論

2.1 固相萃取吸附劑選擇

如圖1所示，總體來看，3種添加劑在固相吸附劑上的吸附能力為山梨酸>苯甲酸>糖精鈉。同時，不同的吸附劑其陽離子強度越大，其吸附效果相對更高，表現為SPE-MCX>SPE.WCX>SPE.SIL。原因為SPE.SIL為二氧化硅基質的固相萃取劑主要用于非極性溶劑中脂肪酸類物質的吸附。而SPE-MCX和SPE.WCX主體基質為N-乙烯基吡咯烷酮—二乙烯基苯共聚物基質對極性分析物有高度的選擇性。SPE-MCX連接有磺酸基團相對SPE.WCX連接的醋酸基團有更強的耐有機溶劑的穩定性。吸附的3種食品添加劑均為極性物質，因此，選取SPE-MCX固相萃取劑為后續的研究對象。

圖1 不同添加劑在不同吸附劑的吸附量

2.2 固相萃取條件的選擇

2.2.1 pH優化 SPE-MCX柱的吸附原理為目標化合物遇到酸化后呈陽離子特征，通過電荷以及分子間力結合，保留在小柱上，通過改變離子強度，pH值和破壞分子間力后洗脫下來。由圖2可知，pH中性條件下，各組分在SPE-MCX固相上幾乎不吸附，而隨著pH值的降低，吸附量隨之增大。當pH為3.5時，控制出料濃度<5%的進料濃度，各物質最佳的吸附量為8 BV。當進一步降低進料pH時，各物質在SPE-MCX固相上的吸附率出現不同程度的降低，考慮到SPE-MCX柱在pH<2時會發生降解的風險，所以選取進料pH為3.5左右作為后續的研究。

圖2 吸附液pH對吸附效果的影響

2.2.2 洗脫液濃度優化 洗脫溶劑的選擇直接影響產品的純度和回收率，為了達到產品的高純度，通常在洗脫之前增加洗雜步驟以保證產品的純度，但是提取高純度的產品不可避免地帶來產品的損失，適合的洗脫溶劑濃度，成為洗脫收率的關鍵。由圖3可知，以純水洗脫時只有極少量的苯甲酸、山梨酸和糖精鈉被洗脫下來，含一定量的甲醇的混合體系有利于產品的洗脫。當用體積分數60%的甲醇溶液洗脫時，使用3 BV的洗脫液，苯甲酸、山梨酸的回收率均接近于100%，當洗脫液達到4 BV時，3種添加劑均可以被完全洗脫，故先采用體積分數為60%的甲醇溶液洗脫，再用純水清洗。

圖3 洗脫液濃度對回收率的影響

2.3 檢測條件優化

2.3.1 波長的選擇 從圖4～圖6可以看出，苯甲酸的全波長掃描發現在對應的吸收波長為224 nm和283 nm有最大吸收峰。糖精鈉也有兩個較大的吸收峰，對應的吸收波長為272 nm和367 nm。山梨酸僅有一處最大吸收波長為254 nm。為兼顧3種食品添加劑的測定，選擇230 nm作為檢測波長。

圖4 苯甲酸全波長掃描圖

圖5 糖精鈉全波長掃描圖

圖6 山梨酸全波長掃描圖

2.3.2 流動相優化 試驗發現，當V乙酸銨∶V乙腈為75∶25時，各物質的分離效果最佳，各組分間分離度良好，峰型對稱度良好(見圖7)，且各物質的保留時間最短。該檢測條件下，苯甲酸的保留時間為2.409 min，山梨酸的保留時間為3.641 min，糖精鈉的保留時間為6.507 min(見表1)。

圖7 3種食品添加劑HPLC色譜圖

表1 3種食品添加劑色譜數據表

2.4 方法學確認

2.4.1 線性范圍與檢測限 從表2可以看出，3種食品添加劑的質量濃度在0.5～10.0 mg/L時，所得到的線性回歸方程具有良好的相關性，決定系數R2>0.990。在該檢測范圍內，對3種食品添加劑的檢測限均達到了微克級別，均能夠滿足食品檢測標準需要。3種食品添加劑的檢測限均遠低于產品控制的添加量限度75 mg/kg。其中，山梨酸檢測限低于糖精鈉和苯甲酸，為3.52×10-2mg/kg，低于GB 5009.28—2016執行的檢出限0.005 g/kg，說明能得到更為精密的檢測結果。

表2 3種食品添加劑線性回歸方程和檢測限

2.4.2 回收率與精密度 由表3可知，3種食品添加劑檢測的平均回收率在95.44%～101.24%，相對標準偏差(RSD)在1.48%～2.92%，滿足在RSD<5%的標準要求范圍內。當質量濃度為0.05～0.50 mg/kg時，回收率為95.44%～99.53%，相對標準偏差≤2.46%；當質量濃度為0.50～1.00 mg/kg時，回收率為97.32%～101.24%，相對標準偏差≤2.92%。因此，該檢測方法準確可靠，適用于同時分析鹵制肉制品3種食品添加劑殘留。

表3 3種添加劑在鹵制肉制品中的添加回收率和相對標準偏差

2.4.3 實際樣品定量分析 分別取3個不同廠家，不同批次的鹵制肉樣品共9份，按1.2.1樣品前處理后，分別檢測，檢測結果見表4。

表4 實際樣品檢測結果

從購買樣品的檢測數據來看，醬鹵肉中苯甲酸和山梨酸食品添加劑殘留值均低于GB 5009.28—2016標準限值(0.075 g/kg)，同時在個別包裝中檢出了糖精鈉的殘留，盡管殘留值很低，僅有0.001 g/kg，但說明個別醬鹵制肉生產廠家沒有嚴格按照國家禁用要求進行管理。糖精鈉曾被作為甜味劑，但因其安全性，中國于2015年禁止其在食品中使用[13]。糖精鈉的檢出，意味著某些食品廠家可能會利用儀器檢測靈敏度的問題，在食品中添加一些國家違禁物來提升食品的風味。因此，建議相關部門建立嚴格的控制和檢測標準，以保證食品安全。

3 結論

試驗依據常規食品添加劑苯甲酸等物質結構特點選擇特異性吸附的固相萃取劑SPE-MCX，有效防止了樣品中脂肪的檢測干擾，產品萃取回收率接近100%。采用HPLC來同時測定苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的殘留，3種添加劑在質量濃度0.5～10.0 mg/L的范圍內，其峰面積與質量濃度呈良好的線性關系，加標回收率為95.44%～101.24%，可以滿足醬鹵肉制品中多種添加劑快速分離檢測要求。以該方法測定了不同批次的市售醬鹵肉產品，發現現有的市售醬鹵肉制品存在質量風險。后續將拓展樣品的覆蓋面，并對方法的使用穩定性和色譜柱的使用壽命等加以驗證。